董传举刘园园刘晓勇宋迎楠徐鹏孙效文

（1. 上海海洋大学水产与生命学院，上海 201306；2. 中国水产科学研究院水产应用基因组中心，北京 100141；3. 中国水产科学研究院鲟鱼国家级良种场，北京 100070）

四种鲟鱼线粒体PCR-RFLP鉴定方法的研究

董传举1，2刘园园2刘晓勇3宋迎楠1，2徐鹏2孙效文2

（1. 上海海洋大学水产与生命学院，上海 201306；2. 中国水产科学研究院水产应用基因组中心，北京 100141；3. 中国水产科学研究院鲟鱼国家级良种场，北京 100070）

利用线粒体序列开发高效准确的分子鉴定方法广泛应用于水产品易混物种的鉴定中。应用PCR-RFLP技术，对鲟鱼易混种开展了分子生物学鉴定方法研究。结果表明，利用一组引物对8种鲟鱼线粒体基因进行PCR扩增，分别应用限制性内切酶Taqα I、Ava II和Eag I-HF、Nae I对扩增产物进行酶切，并用3.0%的琼脂糖凝胶检测PCR产物的酶切结果，可从8种鲟鱼易混种中分别鉴别出中华鲟、小体鲟、达氏鳇以及欧鳇。所建立的方法操作简单，在保证鱼种存活基础上只需剪取少量鳍条，便可快速准确地进行常见鲟鱼和不同鲟鱼产品的鉴别，大大增加了鉴定结果的准确性和可信度，极大地提高了工作效率。

鲟鱼 线粒体DNA PCR-RFLP 鉴定方法 分子标记

鲟鱼（Sturgeon）隶属于硬骨鱼纲（Osteichthyes）、辐鳍亚纲（Actinopterygii）、硬鳞总目（Ganoidomorpha）、鲟形目（Acipenseriformes），目前全世界共有1目2科7属27种［1］。中国是世界鲟鱼品种最多、分布最广、资源最为丰富的国家之一［2］，境内有2科3属8种，分别为施氏鲟（Acipenseridae schrenckii）、达氏鳇（Hoho dauricus）、中华鲟（A. sinensis）、达氏鲟（A. dabryanus）、白鲟（Psephurus gladius）、西伯利亚鲟（A. baerii）、小体鲟（A. ruthenus）、裸腹鲟（A. nudiventris），鲟鱼是一类古老的软骨硬鳞鱼，有“活化石”之称［3］。目前，这些古老的鲟鱼类均处于不同程度的濒危状态［4］，部分物种甚至有灭绝的危险［5］。鲟鱼卵营养丰富，以其卵加工制成的鲟鱼籽酱，价格昂贵，是国际公认的奢侈食材，被比作“黑

色黄金”。

随着我国鲟鱼养殖业的快速发展，很多亟待解决的问题也随之产生。目前许多养殖户和养殖企业培育了多达几十种鲟鱼杂交种，这些杂交种在幼体培育、生长、抗逆、怀卵量等方面性状突出，常常与其纯系亲本种在外形上极其相似，尤其在受精卵和苗种阶段，很难进行辨认和鉴别。而在鲟鱼鱼子酱的贸易中，不同种类来源的鱼子酱的价格差别极大，因此养殖户和生产企业如果不能在苗种早期进行有效的种类鉴定，将承受巨大的经济损失。另外，有些鲟鱼种类是《濒危野生动植物种国际贸易公约》（CITES）［6］附录明确禁止贸易的物种，如中华鲟等，故在鲟鱼制品贸易和监管中需要有效地将这些濒危鲟鱼物种鉴定和区分。

目前国际上进行鲟鱼种类鉴定主要采用的方法包括形态学、生物化学和遗传学等方法。依据这些方法并不能准确区分不同的鲟鱼，从而造成相互混杂，直接影响育种效果。Congiu等［7，8］使用AFLP分子标记方法进行了鲟鱼及鱼籽酱产品的鉴别应用，Chelomina等［9］使用RAPD分子标记进行了施氏鲟自然种群中杂交种的鉴别分析。目前以线粒体为材料来研究鲟鱼类进化关系的研究报道相对也较多，主要集中在线粒体D-Loop序列部分、细胞色素b、12S rRNA、16S rRNA等区域［10］。对线粒体D-Loop的研究发现，多种鲟鱼mtDNA均存在异质现象［11，12］。近年来国内外常用线粒体D-Loop以及微卫星DNA标记开展鲟鱼的分子鉴定［13，14］。这些技术手段尽管能够不同程度地对鲟鱼及其产品进行相对精确的鉴定，但也存在技术操作繁琐、鉴定时间长、设备昂贵等缺点，且对操作人员技术要求较高。故亟须开发高效、快速、准确的鲟鱼种质鉴定技术，用于鲟鱼育种，物种保护以及鲟鱼产品的检测。

本研究通过线粒体序列的比对分析，旨在利用鲟鱼纯种资源，发掘各种鲟鱼的特异突变标签，开发基于PCR-RFLP技术的快速种质鉴别方法。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 试验种质 本研究利用中国水产科学研究院鲟鱼国家级良种场保存的鲟鱼种质资源——中华鲟、施氏鲟、西伯利亚鲟、小体鲟、达氏鳇、欧鳇、闪光鲟和俄罗斯鲟各10尾活体，剪取尾鳍少许放入1.5 μL离心管中，-30℃ 保存。

1.1.2 仪器与试剂 限制性内切酶和PCR试剂均购置于NEB（北京）有限公司，引物由生工生物公司合成，其他试剂均为国产分析纯。PCR仪为Applied Biosystem9902。

1.2 方法

1.2.1 基因组DNA的提取 取上述中华鲟、施氏鲟、西伯利亚鲟、小体鲟、达氏鳇、欧鳇、闪光鲟和俄罗斯鲟鳍条约0.5 g，剪碎，放入1.5 mL离心管中分别编号并应用酚/氯仿抽提法提取基因组DNA，并把同一物种的DNA等量混匀，分别编号1-8。

1.2.2 线粒体DNA的PCR扩增 使用美国食品药品监督管理局（FDA）水产品分子条形码鉴定通用引物［15］扩增上述基因组DNA（表1）。PCR扩增反应体系为15 μL：加入0.1 μL浓度为2 500 U/mL的Taq DNA聚合酶，1.5 μL 10×PCR缓冲液，1.5 μL浓度为10 pmol/μL的dNTPs，1.2 μL 25 mmol/L MgCl2，2 μL所述基因组DNA，浓度为10 pmol/μL的上下游引物各0.5 μL和7.7 μL无菌水。

PCR扩增反应程序为：94℃预变性 5 min；94℃变性30 s，58℃退火30 s，72℃延伸45 s，共35个循环；72℃延伸10 min，4℃保存。

表1 PCR扩增引物

1.2.3 线粒体序列的获取与序列比对分析、差异内切酶位点选取 把上述扩增得到的片段，送往中美泰和（北京）生物公司，进行序列测定。收集各片段序列，在软件MEGA5.1中进行序列比对分析。通过比对分析找出各个物种之间不同的差异，从而选取不同的内切酶进行酶切反应。

1.2.4 限制性内切酶的酶切

1.2.4.1 Taqα I酶切反应 在8个200 μL PCR反应管中，分别加入上述8种PCR产物1 μL，2 μL

10×buffer酶切缓冲液，0.2 μL 100×BSA，0.5 μL限制性内切酶Taqα I，加无菌水至20 μL，所述酶切反应体系在65℃温育反应1 h，80℃热失活20 min，其中10×酶切缓冲液pH值为7.5，成分为100 pmol/μL Tris-HCl，50 pmol/μL NaCl，10 pmol/μL MgCl2，0.025% Triton®×-100。

1.2.4.2 Ava II和Eag I-HF酶切反应 在8个200 μL PCR反应管，分别加入上述8种PCR产物1 μL，2 μL 10×buffer酶切缓冲液，0.2 μL 100×BSA和0.5 μL限制性内切酶Ava II，加无菌水至20 μL，然后将所述酶切反应体系在37℃温育反应1 h，65℃热失活20 min；然后再取200 μL PCR反应管，加入1 μL所述PCR产物，2 μL 10×buffer酶切缓冲液，0.2 μL 100×BSA和0.5 μL限制性内切酶Eag I-HF，加无菌水至20 μL，然后将所述酶切反应体系在37℃温育反应15 min，65℃热失活20 min。其中10×酶切缓冲液pH值为7.5，成分为100 pmol/μL Tris-HCl，50 pmol/μL NaCl，10 pmol/μL MgCl2，0.025% Triton®×-100。

1.2.4.3 Nae I酶切反应 在200 μL PCR反应管中，加入上述1 μL上述产物，2 μL 10×buffer酶切缓冲液，0.2 μL 100×BSA，0.5 μL限制性内切酶Nae I，加无菌水至20 μL，所述酶切反应体系在37℃温育反应1 h，65℃热失活20 min。其中10×酶切缓冲液pH值为7.5，成分为100 pmol/μL Tris-HCl，50 pmol/μL NaCl，10 pmol/μL MgCl2，0.025% Triton®×-100。

1.2.5 琼脂糖凝胶电泳 将PCR产物及所有酶切产物进行琼脂糖凝胶电泳，琼脂糖凝胶浓度为3.0%。电泳结束后，用凝胶图像处理系统采集电泳图，收集数据，计算片段大小。同时把酶切后得到的片段送往中美泰和（北京）生物公司进行序列测定，验证分析结果的准确性。

2 结果

2.1 PCR扩增结果

中华鲟、施氏鲟、西伯利亚鲟、小体鲟、达氏鳇、欧鳇、闪光鲟、俄罗斯鲟线粒体DNA均扩增出单一的片段，未发现其片段长度多态性，测序得到片段大小均为666 bp（图1）。经过序列分析，确定位于mtDNA COXI区域。

图1 线粒体DNA的PCR产物

2.2 序列比对结果

2.2.1 Taqα I酶切位点比对 应用MEGA5.1软件对中华鲟、施氏鲟、西伯利亚鲟、小体鲟、达氏鳇、欧鳇、闪光鲟和俄罗斯鲟进行序列比对。在中华鲟扩增产物中距多核苷酸序列5'端的第586和587位碱基之间的磷酸二酯键为限制性内切酶Taqα I酶切位点（TCGA），施氏鲟、西伯利亚鲟、小体鲟、达氏鳇、欧鳇、闪光鲟和俄罗斯鲟均无该酶切位点（图2）。故可通过限制性内切酶Taqα I对上述扩增片段进行酶切，鉴定出中华鲟。

2.2.2 Ava II及Eag I-HF酶切位点比对 应用MEGA5.1软件对中华鲟、施氏鲟、西伯利亚鲟、小体鲟、达氏鳇、欧鳇、闪光鲟和俄罗斯鲟进行序列比对，发现中华鲟、施氏鲟、西伯利亚鲟、欧鳇、闪光鲟和俄罗斯鲟中，距上述PCR产物多核苷酸序列5'端的第196和197位碱基之间的磷酸二酯键为限制性内切酶Ava II的酶切位点（GGWCC），小体鲟和达氏鳇无该酶切位点；在酶切区分出小体鲟和达氏鳇的基础上，距中华鲟、施氏鲟、西伯利亚鲟、欧鳇、闪光鲟、俄罗斯鲟和达氏鳇上述PCR产物中多核苷酸序列5'端第522和523位碱基之间的磷酸二酯键为限制性内切酶Eag I-HF酶切位点（CGGCCG），小体鲟无该酶切位点（图2）。所以可以通过限制性内切酶Ava II和限制性内切酶Eag I-HF对上述扩增片段进行酶切，故可鉴定出小体鲟和达氏鳇。

2.2.3 Nae I酶切位点比对 应用MEGA5.1软件对中华鲟、施氏鲟、西伯利亚鲟、小体鲟、达氏鳇、欧鳇、闪光鲟和俄罗斯鲟进行序列比对，在中华鲟、施氏鲟、西伯利亚鲟、小体鲟、达氏鳇、闪光鲟和俄罗斯鲟所述PCR产物中距多核苷酸序列5'端的第316和317位碱基之间的磷酸二酯键为限制性内切

酶Nae I的酶切位点（GCCGGC），欧鳇无该酶切位点（图2）。故可通过限制性内切酶Nae I对上述扩增片段进行酶切，从而鉴定出欧鳇。

2.3 酶切结果

2.3.1 内切酶Taqα I酶切 内切酶Taqα I酶切结果，见图3。

图2 序列比对结果及酶切位点

图3 内切酶TaqαI的酶切结果

图4 内切酶Ava II的酶切结果

2.3.2 内切酶Ava II和内切酶Eag I-HF的酶切 内切酶Ava II和内切酶Eag I-HF的酶切结果，见图4和图5。

2.3.3 内切酶Nae I的酶切 内切酶Nae I的酶切结果，见图6。

2.4 结果分析

2.4.1 中华鲟的鉴定 在中华鲟的PCR产物中多核苷酸序列5'的第586和587位碱基之间的磷酸二酯键为Taqα I的酶切位点，故经Taqα I酶切后产生了特异的两条带，而施氏鲟、西伯利亚鲟、小体鲟、

达氏鳇、欧鳇、闪光鲟和俄罗斯鲟无所述酶切位点，所以酶切后电泳结果中只有一条带，从中鉴定出中华鲟。酶切后片段大小见表2。

图5 内切酶Eag I-HF的酶切结果

图6 内切酶Nae I的酶切结果

表2 八种鲟鱼的PCR-RFLP片段大小

2.4.2 小体鲟和达氏鳇的鉴定 在中华鲟、施氏鲟、西伯利亚鲟、欧鳇、闪光鲟和俄罗斯鲟上述PCR产物中多核苷酸序列5'端的第196和197位碱基之间的磷酸二酯键均为Ava II的酶切位点，小体鲟和达氏鳇没有所述酶切位点，所以Ava II酶切后小体鲟和达氏鳇只有一条带，从而把小体鲟和达氏鲟分离出来；在中华鲟、施氏鲟、西伯利亚鲟、欧鳇、闪光鲟、俄罗斯鲟和达氏鳇上述PCR产物中多核苷酸序列5'端的第522和523个碱基之间的磷酸二酯键为Eag I-HF酶切位点，酶切后均产生了特异的两条带，小体鲟无所述酶切位点，酶切后只有一条带，故可以鉴定出小体鲟。所以通过Ava II和Eag I-HF可以鉴定出小体鲟和达氏鲟，酶切后片段大小见表2。

2.4.3 欧鳇的鉴定 在中华鲟、施氏鲟、西伯利亚鲟、小体鲟、达氏鳇、闪光鲟和俄罗斯鲟上述PCR产物中多核苷酸序列5'端的第350和351位碱基之间的磷酸二酯键为Nae I酶切位点，故Nae I酶切后，产生特异的两条带；欧鳇没有所述酶切位点，故酶切后仍只有一条带，所以可以鉴定出欧鳇，酶切后片段大小见表2。

3 讨论

线粒体DNA（mtDNA）作为真核细胞的核外遗传因子，结构十分简单。脊椎动物的线粒体基因大小约16 kb，结构基本相同［16］：1个mtDNA控制区（D-Loop区），13个蛋白质基因，22个tRNA基因。共价双链闭环分子具有自主复制、转录和翻译的能力［17］，并且复制方式简单，结构基因紧凑，无间隔序列和内含子，进化速率是核基因的5-10倍，且缺少有效的DNA损伤修复机制，还有突变累加效应［18］。基因片段大小适中，种间进化速率较快，对于探索物种系统发育极为有效［19］。mtDNA序列的差异可以表明遗传群体在进化过程中的分离，单倍型频率可以揭示地理种群间的转移［20］。由于线粒体DNA的这些特点，mtDNA序列也越来越多地用于研究驯养动物的亲缘关系、起源及其多样性，例如兔子、猪、山羊、水牛、马等［21-26］。

PCR-RFLP技术是最早的分子标记之一，指基于限制性内切酶消化不同长度的限制片段的多态现象。该技术不仅适用于在不同地理群体之间建立分子遗传标记，从而比较不同地理群体之间的亲缘关系，也可以作为区分不同地理群的分子遗传标记［27］。由于扩增总DNA，所以可以有效避免纯化mtDNA

的繁琐步骤并且可以通过PCR方法很好地控制DNA片段大小，酶切位点数，以及扩大模板量，适用于微量组织样品的分析，所以在mtDNA分析中也被广泛使用。由于该技术结果可靠、准确、具有较高的稳定性，并且检测中仅需要少量的组织材料，所以适用于对物种各个发育阶段的鉴别研究［28］。

基于线粒体序列开发高效准确的分子鉴定方法广泛应用于水产品易混物种的鉴定中，如Aoyama等［29］利用mtDNA PCR-RFLP技术开发了欧洲鳗鲡（Anguilla anguilla）和亚洲鳗鲡的快速鉴定方法，Karaiskou等［30］利用mtDNA PCR-RFLP技术对竹荚鱼属3个种成功地进行了分子鉴定等；庄怡等［31］利用PCR-RFLP技术对鲫鱼（Carassius auratus）6个不同品系成功的进行鉴定；王淞等［32］对3个长江野生群体以及一个人工繁殖群体共158尾鲢鱼（Hypophthalmichthys molitrix）mtDNA D-Loop区段进行PCR-RFLP分析从而鉴定4个不同群体的差异；吴海防等［33］采用PCR-RFLP技术对江西瑞昌、湖南长沙、天津宁河3个群体的144尾草鱼（Ctenopharyngodon idellus）DNA D-Loop区段进行了分析，得出草鱼mtDNA D-Loop区段的遗传多样性很低的结论；文菁等［34］基于570 bp左右的mtDNA 16S rRNA基因片段，利用3种核酸内切酶（Dde I，Hae III和Sty I）对16种海参PCR产物进行酶切，分别产生10种、5种和5种单倍型，通过单倍型的组合，即能有效区分16种海参的种类。董丽娜等［35］对北部湾3 种金线鱼属鱼类的mtDNA COI基因序列进行分析，证明了3种金线鱼之间的亲缘关系。汪登强等［36］对13种鲟形目鱼类mtDNA PCR-RFLP分析的结论表明，鲟形目鱼类存在广泛变异且鲟科的6种鱼与匙吻鲟（Polyodon spathala）和白鲟（Psephurus gladius）分成两大支；鲟科中两种鳇鱼没有聚到一起，支持了鳇鱼不能作独立分类单元的观点。

4 结论

本研究基于鲟鱼线粒体DNA开发出常见鲟鱼种类的PCR-RFLP快速鉴定方法。试验过程方便快捷易操作，可在较短时间内快速准确地鉴定出鲟鱼易混种。在不处死鱼种的基础上，剪取少量鳍条，提取待检测样本的基因组DNA，通过1对引物扩增出鲟鱼mtDNA COXI区域的部分片段，应用不同限制性内切酶的酶切作用，即可分别把中华鲟、小体鲟、达氏鲟、欧鳇从其他常见鲟鱼类中鉴别出来。通过PCR扩增片段的限制性酶切，得到的限制性酶切图谱，不但为鲟鱼类中的鉴定提供了大量的分子标记，同时也为进一步构建物理图谱、进化遗传学和育种研究打下了基础；也有利于实际生产部门，科研部门快速鉴定所取样本，增加了鉴定结果的准确性和可信度，极大提高了工作效率。

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（责任编辑 马鑫）

PCR-RFLP Analysis of mtDNA to Identify Four Kinds of Sturgeons

Dong Chuanju1，2Liu Yuanyuan2Liu Xiaoyong3Song Yingnan1，2Xu Peng2Sun Xiaowen2
（1. College of Fisheries and Life Science，Shanghai Ocean University，Shanghai 201306；2. Centre for Applied Aquatic Genomics，Chinese Academy of Fishery Sciences，Beijing 100141；3. National Sturgeon Hatchery，Chinese Academy of Fishery Sciences，Beijing 100070）

With the high efficient and accurate, molecular identification methods are widely used in some easily confused species. So we carried out the research in some miscible species of sturgeons with the application of PCR-RFLP. With the help of one pair primers, we amplified one region of mtDNA in 8 kinds of sturgeons’ which contain Acipenseridae sinensis, A. schrenckii, A. baeri, A. ruthenus, Huso dauricus, H. huso, A. stellatus, A. gueldenstaeti. When digested with the restriction enzyme of Taqα I, Ava II, Eag I-HF and Nae I then test the results of PCR and enzyme digestion reactions with the density 3.0% of agarose gel, A. sinensis, A. ruthenus, H. dauricus, H. huso can be identified from other sturgeons. This method just need one pair of primers which is specific for binding to the mitochondrial DNA to amplify genomic DNA, then digested the products of PCR with different enzymes. So it is convenient to operate and can identify the species accurately in a relatively short period of time. On the basis of a little fin, we can identify common sturgeon species credibility and accuracy and also greatly improved the work efficiency.

Sturgeon mtDNA PCR-RFLP Identification method Molecular marker

10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2014.12.013

2014-05-12

国家“863”计划项目（2011AA100401），农业部公益性行业科研专项项目（200903045）

董传举，男，博士研究生，研究方向：水产基因组学；E-mail：cjd1989@126.com

徐鹏，研究员，研究方向：水产基因组学；E-mail：xupeng@cafs.ac.cn