欧阳德亮 ,胡 杨 ,王又保 ,黄明明 ,谢荣兵

(1.南华大学附属第三医院普外科,湖南衡阳421900;2.南华大学附属南华医院消化内科)

胃癌是我国最常见的消化系统恶性肿瘤之一。跟其他肿瘤类似,也是一个多因素、多步骤、多阶段的复杂过程,涉及到宿主体内的基因型以及表型的变化。虽然早期手术治疗可挽救部分患者的生命,但对于晚期患者而言,化疗依然是主要治疗手段。尽管目前用于胃癌化疗的药物众多,但因副作用等因素限制了其使用。穿心莲内酯(Andrographolide,AD)是一类具有消炎解毒功能的二萜类化合物,以往多用于临床上各种感染性疾病的治疗[1-2]。但近年有研究显示,这种化合物对人类多种肿瘤细胞生长具有一定的抑制效应[3]。近年研究显示,在肿瘤的发生发展过程中,Na+-K+-ATP酶可能参与肿瘤细胞的增殖[4]。此外,血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor,VEGF)和转化生长因子β1(transforming growth factor-β1,TGF-β1)以及基质金属蛋白酶(matrix metalloproteinase-9,MMP-9)等也广泛参与癌细胞的黏附、侵袭及迁移。本研究旨在观察穿心莲内酯对胃癌细胞生长增殖的影响,并初步探讨其可能的机制。

1 材料与方法

1.1 试剂

穿心莲内酯(纯度98%)购自Sigma-Aldrich化学制品公司,用 DMSO溶解使其成为浓度为15 mmol/L的贮存液。细胞培养基为Invitrogen产品,培养板购自Corning公司。其他试剂均购于上海生工。Trizol试剂购自Invitrogen公司。RT-PCR试剂盒购自大连宝生物公司。The SensoLyte MMP-9活性检测试剂盒购自AnaSpec公司。

1.2 细胞培养

人胃癌细胞系AGS用含10%胎牛血清的RPMI 1640培养基中在37℃含有5%CO2的环境下培养,其中包含了100单位/mL的青霉素和100单位/mL的链霉素(pH 7.4)。每3天更换培养基或进行细胞传代培养。用于各种实验和分析的细胞密度约为105/mL。

1.3 Na+-K+-ATP酶活性分析

根据酶促反应释放的无机磷(Pi)的含量反应ATP酶的活性。反应体系中含有20 mmol/L KCl、100 mmol/L NaCl、30 mmol/L Tris 缓冲液(pH 7.4)以及新鲜细胞线粒体分离物。当反应体系加入2 mmol/L ATP后,30℃孵育15 min,接着加入15%三氯乙酸终止反应。通过测量640 nm处的吸光度分析释放的无机磷的含量。ATP酶活性的定义:1 mg蛋白质1 h内催化ATP生成1 μmol/L无机磷的量为1个单位ATP酶活性,并计算其相对活性,公式为:相对活性=处理组酶活性/对照组酶活性×100%。

1.4 细胞增殖分析

为了检测细胞的生存能力,进行MTT分析。利用0.25 mg MTT/mL在37℃下孵育实验细胞。利用全自动定量绘图酶标仪通过测量570 nm(630作为参考)下的吸光度。细胞抑制率=(空白组OD值-处理组OD值)/空白组OD值×100%。

1.5 DNA断裂的测量

采用ELISA测量DNA断裂情况。细胞经不同浓度的穿心莲内酯孵育之后,室温下裂解癌细胞30 min,接着200 g下离心10 min。然后将20 μL上清液转移至抗生蛋白链菌素包被的培养板中,并且每孔加入80 μL新配制的免疫试剂,在室温下孵育2 h。利用PBS冲洗之后,加入底物溶液,并孵育15 min。利用全自动定量绘图酶标仪测量405 nm处的吸光度(参考490 nm的波长)。计算断裂DNA的相对含量=样本吸光度/对照组吸光度×100%(样本:穿心莲内酯处理的细胞;对照组:未用穿心莲内酯处理的细胞)。

1.6 VEGF和TGF-β1水平的测定

利用不同浓度的穿心莲内酯预处理细胞48 h。利用PBS冲洗之后,接着用10 ng/mL的TNF-α孵育样本18 h。利用ELISA工具测定VEGF和TGF-β1在细胞培养上清液中的水平。

1.7 MMP-9活性测定

细胞处理结束后,获取上清,采用间接法测定MMP-9的酶活性。其步骤根据 AnaSpec公司的SensoLyte®490 MMP-9 Assay Kit提供的步骤进行。本试剂盒含有EDANS/DabcylPlusTM荧光共振能量转移肽,在这条完整的肽当中,DabcylPlus将EDANS荧光淬火,而此肽被MMP-9特异性降解后,EDANS重新获得荧光,在荧光酶标仪上测定其强度(与MMP-9的活性成正比,激发/发射波长分别为340 nm和490 nm),并计算各组与对照组的比值(相对活性)。

1.8 侵袭力分析

制备AGS细胞悬液(3×106/mL),同时将Matrigel铺在 Transwell滤膜上(40 μL/孔),紫外照射12 h。Transwell的上室加入细胞悬液100 μL,下室加入500 μL完全培养基。5%CO2条件下培养24 h。取出小室,甲醇4℃固定10 min,并加入结晶紫染色5 min,PBS洗涤后擦去上表面细胞,并随机选择5个视野,计算穿膜细胞数目。

1.9 统计学分析

数据用均数±标准差表示,用SPSS 17.0统计软件处理数据并进行方差分析(ANOVA),组间比较采用LSD分析。P＜0.05为差异有显著性。

2 结 果

2.1 不同浓度穿心莲内酯对Na+-K+-ATP酶活性的影响

不同浓度的穿心莲内酯作用AGS细胞24 h后,能在一定程度上抑制细胞内Na+-K+-ATP酶活性。其中1.0 μmol/L穿心莲内酯能使酶活性降低至86%,3.0 μmol/L 时其活性为 59%,而 5.0 μmol/L穿心莲内酯能使Na+-K+-ATP酶活性降低至48%,见图1所示。

图1 不同浓度穿心莲内酯对Na+-K+-ATP酶活性的影响1:对照组;2:1.0 μmol/L穿心莲内酯;3:3.0 μmol/L穿心莲内酯;4:5.0 μmol/L穿心莲内酯.与对照组(0 μmol/L)比较,*:P＜0.05

2.2 穿心莲内酯对AGS细胞生长增殖的影响

MTT结果显示,在同一时间点,不同浓度的穿心莲内酯能有效抑制AGS细胞生长增殖,且随着浓度的增高抑制作用增强。在相同浓度作用下,随作用时间的延长,对AGS细胞的抑制作用越明显(表1)。

表1 穿心莲内酯在不同浓度及不同时间作用下对AGS细胞抑制率的影响(%)

2.3 穿心莲内酯对断裂DNA含量的影响

如图2所示,1.0 μmol/L穿心莲内酯孵育48 h后能轻微增加断裂DNA的含量。随着浓度的增高,其断裂DNA含量随之增多。

图2 不同浓度穿心莲内酯对断裂DNA含量的影响 1:对照组;2:1.0 μmol/L穿心莲内酯;3:3.0 μmol/L穿心莲内酯;4:5.0 μmol/L穿心莲内酯.与对照组(0 μmol/L)比较,*:P ＜0.05

2.4 穿心莲内酯对AGS细胞中VEGF及TGF-β1含量的影响

ELISA结果显示,随着穿心莲内酯浓度的增高,VEGF和TGF-β1的水平逐渐降低(P＜0.05,表2)。

表2 不同浓度穿心莲内酯对AGS细胞中VEGF及TGF-β1水平的影响

2.5 穿心莲内酯对AGS细胞MMP-9酶活性的影响

MMP-9间接酶活性结果显示,1.0、3.0、5.0 μmol/L穿心莲内酯处理后,与对照组相比,MMP-9活性明显降低。其中5.0 μmol/L穿心莲内酯能将MMP-9的酶活性降低47.5%,见图3。

2.6 穿心莲内酯对AGS细胞侵袭的影响

不同浓度穿心莲内酯作用AGS细胞6 h后,对细胞侵袭力的影响见图4和表3所示,1.0～5.0 μmol/L穿心莲内酯均能不同程度降低AGS细胞的侵袭力(P＜0.05)。

图3 不同浓度穿心莲内酯对MMP-9活性的影响 1:对照组;2:1.0 μmol/L 穿心莲内酯;3:3.0 μmol/L 穿心莲内酯;4:5.0 μmol/L穿心莲内酯.与对照组(0 μmol/L)比较,*:P ＜0.05

图4 穿心莲内酯对AGS细胞侵袭力的影响(×20)A:0 μmol/L 穿心莲内酯;B:1.0 μmol/L 穿心莲内酯;C:3.0 μmol/L穿心莲内酯;D:5.0 μmol/L穿心莲内酯

表3 穿心莲内酯对AGS细胞侵袭力的影响

3 讨 论

诱导细胞凋亡是癌症治疗的目标,而DNA断裂是细胞凋亡的重要指标。本研究发现1.0～5.0 μmol/L的穿心莲内酯处理后可显著增加胃癌细胞断裂DNA的含量,可能是由于穿心莲内酯渗入胃癌细胞后破坏了质膜的完整性,最终引起细胞凋亡。Na+-K+-ATP酶为三羧酸循环的关键酶,是由一个α-亚单位和一个β-亚单位组成的异二聚体。而α-亚单位是一种跨膜蛋白,可用于细胞内Na+和细胞外K+的交换。因此,Na+-K+-ATP酶对于维持离子动态平衡很关键[5]。若外源性诱导该酶功能异常,则可触发线粒体膜的瓦解而促进细胞凋亡的发生。有研究发现抑制Na+-K+-ATP酶的活性,能有效抑制肿瘤细胞的增殖、侵袭及转移,其机制可能通过改变α-亚单位的稳定性而影响线粒体功能,最终导致凋亡的发生[6]。VEGF和TGF-β1是肿瘤发生发展过程中的血管生成因子。TGF-β1是包括胃癌在内的一种重要肿瘤生长调节物质[7-8]。研究表明,TGF-β1通过它的免疫抑制效应从而增强胃癌细胞的转移[9]。本研究显示经穿心莲内酯处理后,VEGF和TGF-β1在胃癌细胞中含量明显降低,这表明穿心莲内酯可能在一定程度上减弱胃癌细胞中血管生成和纤维发生。癌细胞的侵袭和迁移是癌症复发及迁移的关键进程。此转移过程与MMP-9的活性密切相关。MMP-9是一种内肽酶,可降解细胞外基质成分,使得癌细胞进入脉管和淋巴系统[10],因此其在肿瘤中的作用已经日益受到重视[11]。本研究证实,穿心莲内酯能显著抑制MMP-9的活性,最终减弱胃癌细胞的侵袭和迁移。

总之,浓度为1.0～5.0 μmol/L的穿心莲内酯能抑制Na+-K+-ATP酶的活性,从而可能诱导细胞凋亡的发生。此外,这种二萜化合物也能抑制VEGF和TGF-β1的产生并抑制MMP-9的活性,从而可能抑制血管的发生以及减少胃癌细胞的侵袭。尽管这些结果说明穿心莲内酯可引起细胞凋亡或延缓胃癌的迁移,但是该药物对于缓和胃癌进展的效应、作用方式以及适当的剂量,还需要进行进一步的体内研究。

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