农药与DNA相互作用的光谱法分析

2014-03-22许杭杰李婧张全周聪陆美娅叶景甲

湖北农业科学 2014年1期

许杭杰+李婧+张全+周聪+陆美娅+叶景甲

摘要：综述了光谱方法在农药与DNA相互作用研究中的应用，重点介绍了紫外光谱法、荧光光谱法、圆二色光谱法、红外光谱法、共振光散射和拉曼光谱法等的原理和应用。光谱法不但是研究农药与DNA相互作用的有效工具，同时也可以加强对农药的遗传毒性分子机理的理解。

关键词：光谱法；农药；DNA；相互作用

中图分类号：TQ450.2 文献标识码：A 文章编号：0439-8114（2014）01-0005-03

Spectroscopic Analyses on the Interaction of Pesticides and DNA

XU Hang-jie，LI Jing，ZHANG Quan，ZHOU Cong，LU Mei-ya，YE Jing-jia

（Environmental Science Research Center， Zhejiang University of Technology， Hangzhou 310032， China）

Abstract： Analyzing the interaction of DNA and pesticides with spectrometry including ultraviolet-visible absorption spectroscopy， fluorescent spectroscopy， circular dichroism spectroscopy， infrared spectroscopy， resonance light scattering spectroscopy and Raman spectroscopy was reviewed. Results showed that spectroscopy was highly effective and powerful for studing the interaction of DNA and pesticides， and would promote understanding molecular mechanisms of the genotoxicity of pesticides.

Key words： spectroscopy； pesticide； DNA； interaction

收稿日期：2013-06-25

基金项目：中国博士后科学基金面上项目（2012M521180）

作者简介：许杭杰（1989-），男，浙江杭州人，在读硕士研究生，研究方向为农药与DNA的相互作用，（电话）0571-88320265（电子信箱）

xuhj-tobe-ceo@163.com；通讯作者，张全，博士，（电子信箱）quanzhang@zju.edu.cn。

农药是一类由人类主动投放到环境当中用来防治农作物病虫草害和其他有害生物的药剂的统称。随着社会的发展和农业集约化要求的不断加强，对农药的需求也在不断增加，在今后相当长的时间内农药的作用是不可替代的。然而大量的事实证明，农药的广泛使用已经成为环境污染的重要原因之一。DNA是生物体的重要组成部分，是生物遗传信息的主要载体。农药能通过饮食、呼吸、皮肤接触等途径进入机体，可能与DNA相互作用后不同程度地导致DNA的结构及其功能的变化，对生物体产生持久性危害[1-4]，进而引发潜在的生态安全和健康风险。因此，关于农药与DNA之间相互作用而导致遗传物质诱变已成为当今研究的热点[5]。

农药与DNA的作用方式主要有三种：非共价键结合、共价键结合和剪切作用。其中非共价键结合又可分为静电结合、沟槽结合和嵌插结合[6]。农药与DNA作用后可能导致DNA构象变化、链聚合或断裂、碱基脱落、碱基被修饰、交联、重组等[7-9]，亦即体系的结构和化学性质会发生一定变化（图1）。人们采用多种方法（生物学方法、光谱法、电化学法和色谱法等）从不同角度探索这些变化，进而判断作用方式和阐述作用机理[10]。本文综述了常用于研究农药与DNA相互作用的光谱方法原理和应用。

1 紫外可见光谱法

紫外可见光谱法是研究农药与DNA相互作用的一种最方便、最常用的技术[11]。小分子与DNA的相互作用会引起吸收带的红移（蓝移）现象或增色（减色）效应。增色效应是DNA双螺旋结构被破坏的结果，减色效应则是DNA分子轴向收缩、构象变化的结果。吸光度减小、吸收带红移以及等吸收点的形成是小分子与生物DNA发生嵌插作用的光谱标志[12]。嵌插作用对DNA的双螺旋结构起稳定作用，可导致熔链温度Tm值增大5～8 ℃，而非嵌插作用的小分子不会使Tm值增大得如此明显。邵华等[11]已采用紫外光谱法研究农药的DNA加合作用，结果表明马拉硫磷、呋喃丹、氯氰菊酯及两两混配后均可能与哺乳动物DNA结合，引起DNA的紫外谱图发生明显的波长位移，甚至产生新的波峰[12]。Farhad等[13]也利用紫外和荧光光谱法发现二嗪农能使小牛胸腺DNA（Calf thymus DNA，ct DNA）光谱产生蓝移。此外，刘伟等[14]研究了农药毒死蜱对小牛胸腺DNA和蚕豆根尖细胞的损伤作用。结果表明，它使得小牛胸腺DNA吸收光谱在207 nm处的吸收峰出现红移现象，随着药剂浓度的增加，谱图出现了减色效应。

2 荧光光谱法

荧光光谱法作为一种快速、灵敏的光谱分析方法也广泛用于农药与DNA相互作用的研究。通过对荧光参数（如荧光偏振、荧光强度等）的测定，可获得许多关于农药与DNA相互作用的信息。农药与DNA作用后荧光偏振的变化是判断农药是否与DNA发生嵌插作用的标志之一。借助荧光强度的变化，可测得农药与DNA的结合常数、结合位点数和作用方式等。

对于荧光很弱的农药，可借助荧光探针进行研究。溴化乙锭（Ethidium bromide，EB）是较为常用的一类探测农药与DNA相互作用的荧光探针，利用EB-DNA体系的荧光变化，可判定农药与DNA的作用方式。孟庆翔等[15]选用溴化乙锭（EB）为荧光探针，考察了阿特拉津浓度、磷酸盐、离子强度以及碘化钾对系统荧光的影响。结果表明，阿特拉津对ctDNA-EB体系的荧光存在淬灭现象，并同时存在静态和动态两种淬灭方式。张立金等[16]对农药甲萘威（Carbaryl）对ct DNA的损伤作用也进行了初步的探讨，证明甲萘威的确对DNA具有一定的损伤作用，而这种损伤可能和甲萘威与DNA的相互作用有关。

3 圆二色光谱法

圆二色光谱（Circular dichroism，CD）是测定样品对左、右旋偏振光的吸光度差。样品是否有圆二色性取决于样品的发色团是否具有手性。一般可通过农药对DNA的圆二色信号的改变判断DNA构象的变化，如果DNA在280 nm附近圆二色信号无变化，可排除农药与DNA作用方式是嵌插作用。Soheila等[17]对二嗪农对DNA的CD光谱进行了研究，结果在280 nm处发现峰形未发生变化，表明二嗪农与DNA的作用是非嵌插作用。Farhad等[18]用CD证明了有机氯杀虫剂2，4-D与DNA亦可发生作用。

4 红外光谱法

当红外光照射时，物质的分子将吸收红外辐射，引起分子的振动和转动能级间的跃迁，所产生的分子吸收光谱成为红外吸收光谱。近年来，傅里叶变换红外光谱法在小分子与DNA相互作用的研究中得到了广泛应用。文献[19]报道了致癌物质Diethylstilbestrol（DES）与ct DNA之间的作用模式、结合常数、序列选择性以及DNA结构和构象的变化情况。当DES浓度较低时，A·T富集区是DES与DNA发生嵌插作用的主要位点，伴随着这种嵌插结合过程，DNA逐渐由B型向A型转变；当DES药物浓度较高时，DES与G·C碱基发生作用，并削弱了DNA双螺旋结构的稳定性。Zhou等[20]通过红外等光谱手段研究了聚二烯丙基二甲基氯化铵（PDDA）与DNA之间的作用方式。红外光谱研究结果表明，PDDA与DNA分子中的碱基和磷酸基团发生了作用，且DNA/PDDA复合物的形成导致DNA二级结构构象发生了变化。

5 共振光散射和拉曼光谱法

共振光散射技术一般检测物体的共振瑞利光信号。利用农药诱导DNA共振光信号的变化可探测DNA的构象变化、聚集和超螺旋结构的形成，进而推断农药与DNA的作用方式[21，22]。拉曼光谱属于振动光谱，共振拉曼效应极大提高了拉曼光谱的灵敏度。拉曼光谱法对农药与DNA的分析主要研究其构象的变化、碱基的损伤、氢键的断裂和单双链的断裂等。周殿凤等[23]的研究结果表明，ct DNA在253.7 nm处受到紫外辐射的损伤作用最严重，DNA的构象受到破坏，DNA的构型发生变化，部分单双键发生断裂，出现了各种各样由于DNA键断裂产生的多核苷酸。Wen等[24]运用拉曼光谱对病毒DNA在不同波段处的吸收进行了研究。

综上所述，光谱方法在农药与DNA相互作用的研究中应用十分广泛，不同的光谱法互相验证可提供更准确的信息。紫外方法检测紫外吸收的差别有简单、准确的特点，但紫外可见光谱反映的信息量有限；荧光光谱有多种荧光参数可利用，能推断农药与DNA的结合常数、结合位点数和作用方式等；而且紫外方法和荧光方法又常受限于一些物质，如紫外吸收信号或荧光信号弱，又或与DNA光谱重叠等问题。圆二色谱、红外色谱、共振光散射和拉曼光谱法都是检测DNA结构变化的有效方法，圆二色谱对手性分子的检测具有一定的优势，有可能在手性农药与DNA相互作用的研究中发挥更大的作用。红外光谱由于受水的红外吸收的影响而限制了其在水溶液体系中的应用。因此，研究农药与DNA的相互作用常要求结合多种光谱方法互相验证。

6 展望

目前，关于农药与DNA相互作用的研究主要集中在少数几种农药上，且基本上使用紫外光谱法、荧光光谱法和彗星实验这三种方法来评价农药对DNA的损伤作用。如果再结合其他的分析技术如电化学方法等从不同角度进行多方位、多层次的研究，对农药与DNA作用的方式和机理的了解会更加深入。此外，随着手性农药在目前使用的农药中所占比例越来越大，以及它们在生物体上表现出的潜在生物效应如毒性、致癌性、致突变性等对映体的选择性[25]，建立一种能够准确可靠的研究手性农药对映体水平上遗传毒性的差异的快速评价方法将显得尤为重要，因此开展手性农药与DNA相互作用研究的光谱法研究是一个重要的领域，能为手性农药的环境安全性评价提供更为宝贵的科学依据。

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（责任编辑王贵春）