张 佳，闫 敬，戴 梦，任志红

（华北制药集团新药研究开发有限责任公司 河北省工业微生物代谢工程技术研究中心，河北石家庄050015）

夫西地酸是由丹麦利奥制药公司于1962年首次从脂球真菌（Fusidium coccineum fungus）中提取出来的。夫西地酸在国外广泛应用50余年，对多种细菌敏感但却极少出现耐药［1－2］，具有其它抗生素所没有的抑菌杀菌和抗炎免疫调节的双重特性。其独特的抗菌机理是：通过干扰延长因子G、阻断核糖体易位来抑制细菌蛋白质的合成［3］，从而避免与其它抗生素的交叉耐药性［4］。

作者在此采用常压室温等离子体（ARTP）射流诱变和紫外（UV）照射对夫西地酸生产菌进行复合物理诱变［5］，并针对高产突变菌株进行发酵培养基碳、氮源的均匀设计优化［6］，以更有效地提高夫西地酸产量，为工业化生产奠定基础。

1 实验

1.1 菌株与培养基

出发菌株FA－30，自行保存。

分离与斜面培养基：酵母粉0.6%，麦芽粉2%，葡萄糖0.6%，碳酸钙2%，琼脂2%，pH值7.0。

活化培养基：酵母粉0.6%，麦芽粉2%，葡萄糖0.6%，碳酸钙2%，pH值7.0。

母瓶培养基：葡萄糖1%，糊精2%，七水合硫酸镁0.1%，磷酸氢二钾0.06%，蛋白胨0.5%，酵母粉0.6%，碳酸钙0.2%，pH值7.0。

发酵培养基：糊精1.8%，花生饼粉1.5%，蛋白胨0.5%，氯化铵0.3%，七水合硫酸镁0.3%，硫酸钾0.6%，碳酸钙1%，pH值7.2。

1.2 方法

1.2.1 种子斜面培养

将保存的出发菌株液氮管转接至斜面培养基，25℃下培养7d后备用。

1.2.2 常压室温等离子体射流诱变与紫外照射复合诱变

将出发菌株斜面以无菌蒸馏水10mL刮下孢子制成孢子液，用玻璃珠打散后取10μL涂布于直径为0.5cm的不锈钢反应钢片上，反应距离为2mm，注入氦气（流量10L·min－1），100W处理5min。然后用1mL无菌蒸馏水洗涤钢片，将所得菌液接入10mL活化培养基25℃下活化24h后，以过滤吸管取4mL活化菌孢子液进行紫外诱变（诱变条件为15W、36 cm、1min），将紫外诱变后的孢子液稀释，以不同梯度涂布于分离培养基平皿中，25℃下培养5～7d。

1.2.3 斜面与摇瓶培养

用接种针挑选单个菌落转接于斜面培养基，25℃下培养7d后将斜面上的孢子接种于母瓶培养基中，于25℃、220r·min－1摇床培养36h。待母瓶长成后以5%的接种量接种于发酵培养基中，于25℃、220r ·min－1摇床培养120h后，放瓶，采用高效液相色谱法测定发酵效价（μg·mL－1），挑选相对高产菌株。

1.2.4 发酵培养基碳、氮源的优化

针对筛选得到的高产菌株，运用均匀设计实验对发酵培养基的碳、氮源进行优化。以糊精、花生饼粉、蛋白胨、氯化铵为基础碳、氮源，考察不同碳、氮源对相对发酵效价（基于出发菌株FA－30）的影响，以得到更加优化的发酵培养基配方。应用软件为均匀设计V4.0。

2 结果与讨论

2.1 诱变育种结果

夫西地酸生产菌经常压室温等离子体射流诱变与紫外照射复合诱变后自分离培养皿中得到276个菌落，接斜面后，经多次摇瓶筛选得到3株高产突变菌株AU－15、AU－37、AU－88，平均发酵效价较出发菌株FA－30提高14%，其中突变菌株AU－37的发酵效价提高17%。

2.2 发酵培养基优化结果

针对诱变筛选得到的突变高产菌株AU－37进行发酵培养基优化。以糊精（X1）、花生饼粉（X2）、蛋白胨（X3）、氯化铵（X4）为自变量，相对发酵效价（Y）为因变量，进行均匀设计实验。均匀设计实验的因素与水平见表1。

采用最优回归子集法得到相对发酵效价（Y）与4个因素的回归方程：Y＝31.3418829＋153.8538016 X1－426.4993159 X3－62.9280683 X21＋267.2214172 X1X3＋556.6651815 X22－176.6655414 X23，相关系数R2＝0.9988。

对回归方程的各项参数进行方差分析，结果见表2。

表1 均匀设计实验的因素与水平／%Tab.1 Factors and levels of uniform design experiment／%

表2 方差分析Tab.2 Analysis of variance

由表2可知，P值和相关系数R2值均在合理范围，符合统计学要求，说明方程拟合度高，具显著意义。

糊精、花生饼粉、蛋白胨、氯化铵对相对发酵效价的影响见图1。

图1 糊精（a）、花生饼粉（b）、蛋白胨（c）、氯化铵（d）对相对发酵效价的影响Fig.1 Effects of dextrin（a），peanut cake powder（b），peptone（c）and ammonium chloride（d）on relative fermentation potency

由图1可知：糊精、蛋白胨均在实验选取范围内得到最优解；花生饼粉对相对发酵效价有明显的促进作用，但由于花生饼粉含量过高会使发酵液过于黏稠，不建议继续增大浓度，即选择最大值作为最优解；氯化铵对相对发酵效价影响最小，直接选取最大值作为最优解。因此，所得最优解为：X1＝1.8609%、X2＝ 2.5000%、X3＝0.3000%、X4＝0.5000%，此时Y＝139.85532%。

2.3 发酵培养基优化配方的验证

按照均匀设计实验得到的优化配方进行3批平行实验，其相对发酵效价分别为112.2%、116.7%、114.3%，平均相对发酵效价为114.4%，即发酵效价较用初始配方发酵的突变菌株AU－37提高14.4%，较出发菌株FA－30提高33.8%。且指标优于实验设计中任一配方。

最终得到的发酵培养基优化配方为：糊精1.86%、花生饼粉2.5%、蛋白胨0.3%、氯化铵0.5%、七水合硫酸镁0.3%、硫酸钾0.6%、碳酸钙1%、pH值7.2。

3 结论

利用常压室温等离子体射流诱变和紫外照射对夫西地酸生产菌株FA－30进行复合诱变，经多次筛选得到了较出发菌株发酵效价提高17%的突变菌株AU－37，并采用均匀设计实验对菌株的发酵培养基进行优化，得到优化配方为：糊精1.86%、花生饼粉2.5%、蛋白胨0.3%、氯化铵0.5%、七水合硫酸镁0.3%、硫酸钾0.6%、碳酸钙1%、pH值7.2。AU－37以此配方进行发酵的发酵效价较初始配方提高14.4%，较出发菌株FA－30提高33.8%，表明，常压室温等离子体射流诱变和紫外照射复合诱变是选育夫西地酸高产菌株的有效手段，而将此手段与均匀设计相结合，可以使菌种选育效率最大化。

［1］ COLLIGNON P，TURNIDGE J.Fusidic acid in vitro activity［J］.Int J Antimicrob Agents，1999，12（S1）：45－58.

［2］ TURNIDGE J.Fusidic acid pharmacology，pharma cokinetics and pharmacodynamics［J］.Int J Antimicrob Agents，1999，12（S2）：23－34.

［3］ 陆一鸣，望亭松.夫西地酸国外应用现状及进展［J］.中国感染控制杂志，2002，（1）：71－74.

［4］ WILKINSON J D.Fusidic acid in dermatology［J］.Br J Dermatol，1998，139（S 53）：37－40.

［5］ 庞德钦，周蓬蓬，鲁明波，等.等离子体－紫外线复合诱变选育高产谷胱甘肽酵母菌［J］.生命科学研究，2007，11（3）：238－241.

［6］ 关亚鹏，娄忻，张莉，等.均匀设计法优化咪唑立宾发酵培养基配方［J］.中国抗生素杂志，2008，33（8）：471－473.