江 军，李军星，康 磊，3，袁秀芳，徐丽华，王一成

副猪嗜血杆菌四环素耐药基因TetB的PCR检测方法建立

江 军1，2，李军星1，康 磊1，3，袁秀芳1，徐丽华1，王一成1

（1.浙江省农业科学院 畜牧兽医研究所，浙江 杭州 310021；2.南京农业大学 动物医学院，江苏 南京 210095；3.安徽农业大学动物科技学院，安徽 合肥 230061）

在本实验室前期研究的基础上，选取与四环素耐药表型相关性较好的TetB基因，建立PCR方法，以探索副猪嗜血杆菌耐药性的快速检测方法。本研究利用四环素主要耐药基因TetB的引物，对PCR反应条件进行优化，以副猪嗜血杆菌基因组DNA为模板，未出现非特异性扩增条带，PCR扩增条带单一。将TetB基因克隆至pMD 19T载体，以重组质粒为标准品，确定了最低检测拷贝数，经测定，最低检测拷贝数为1.54×103。以不同稀释度的21A7菌株基因组DNA为模板，确定了最低细菌检出量，经测定，最低检测细菌数量为4.6×103个。该方法为建立临床快速检测副猪嗜血杆菌耐药性奠定了基础。

副猪嗜血杆菌；耐药基因TetB；PCR检测

副猪嗜血杆菌（Haemophi1us parasuis，Hps）是猪格拉泽氏病（G1asser′s disease）的病原菌，引起猪多发性浆膜炎、关节炎和脑膜炎等［1］。近年来，猪繁殖与呼吸综合征、猪圆环病毒病等免疫抑制性疾病常继发Hps感染而增加发病率和死亡率，给养猪业造成了严重的损失［2］，是目前影响浙江省养猪业最严重的细菌之一［3］。

细菌对四环素产生耐药的机制有3种。一是核糖体保护机制，编码核糖体保护蛋白与核糖体结合，阻止四环素与核糖体的结合，保证细菌蛋白质顺利合成，耐药基因有TetM，TetO，TetS，TetW，TetQ，TetT等［4］；……