张洪杰，李文凯，刘 娜

(江苏科技大学生物与化学工程学院，江苏镇江212003)

我国是世界柑桔大国，橘皮中富含橙皮甙、桔皮素、果胶以及色素、黄酮类和纤维素等多种生物活性成分，采用高科技手段将其“吃光用尽”是可能的，预期的经济效益也是显而易见的.目前对橘柑皮渣的利用主要有两个途径:一是从中提取精油、色素、果胶、橙皮苷等;另一个是利用微生物技术发酵，果醋、乳酸饮料等食品添加剂主要就是利用微生物技术发酵果皮生产出来的.植物中黄酮类化合物的提取是近年来具有研究意义的课题，常见的提取黄酮类化合物的方法有溶剂萃取法、酶法、超临界流体萃取法［1］、超声波提取法、微波提取法等［2］.由于其具有较好的抗氧化性及自由基的清除作用，黄酮类化合物越来越受到人们的重视［3］.

本实验以橘皮为原料，超声辅助乙醇浸取的方法提取橘皮中的黄酮类物质，讨论超声波功率、乙醇浓度、提取时间、液料比等4个因素对总黄酮提取率的影响;通过Design－Expert V8.0.6软件设计橘皮中总黄酮提取率工艺实验，并通过响应面法优化法确定最佳提取工艺;采用Fenton反应的方法建立反应体系模型［4］，在相同条件下，比较橘皮提取液和VC对羟基自由基的清除效果.

1 实验

1.1 材料和试剂

橘皮(超市购买，产地广州)、芦丁(生化试剂，国药集团化学试剂有限公司)、亚硝酸钠、无水乙醇、氢氧化钠、硝酸铝、氯化铝、邻二氮菲、氯化铁、双氧水、氯化亚铁、浓盐酸、抗坏血酸(Vc)(均为分析纯).

1.2 实验仪器设备

紫外可见光分光光度计UV－3010(上海精宏实验设备有限公司)、电子天平FA2004(上海精密仪器制造厂)、电热恒温鼓风干燥箱101A－2(上海市实验仪器总厂)、超声波清CQ－250DB(上海第三分析仪器厂)、离心沉淀机80－2B(上海市实验仪器总厂)等.

1.3 实验方法

1.3.1 总黄酮提取的工艺路线

橘皮干燥→粉碎→超声辅助乙醇浸取→抽滤得滤液→硝酸铝显色法测定吸光度→计算总黄酮量.

称取一定量的橘皮粉于锥形瓶中，加入乙醇溶液超声浸取，精确移取适量的提取液置于25.00 mL的比色管中，用60%的乙醇稀释到10.00mL，加入5%的亚硝酸钠溶液1.00mL，摇匀，静置6 min;加入10%硝酸铝溶液1.00mL，摇匀，静置6 min;加入4%氢氧化钠10.00mL，蒸馏水定容至刻度，摇匀，静置15min后在510 nm处测定其吸光度［5］.

1.3.2 橘皮总黄酮的提取及测定

将芦丁置于干燥箱内120℃条件下恒重1.5h，然后精确称取芦丁标准品20mg，用60%乙醇溶解，配成100mL的溶液，备用，此时芦丁标准溶液浓度为0.2mg/mL.

精确移取芦丁标准溶液 0.00，1.00，2.00， 3.00，4.00，5.00，6.00mL于7支25mL的比色管中，其他条件参照1.3.1进行实验，以0.00mL为空白溶液，以吸光度和芦丁溶液浓度作图，绘制标准曲线，得C=0.0977A+0.000 6(R2=0.9996，在0.008～0.048 mg/mL范围内呈良好的线性关系).

1.3.3 总黄酮质量与提取率的计算

根据标准曲线计算总黄酮的质量

式中:m为总黄酮质量(g);A为样品溶液吸光度;V为过滤后的体积(mL);w为稀释倍数.

式中:y为总黄酮提取得率(%);m为总黄酮质量(g);M为原料质量(g).

1.4 橘皮中提取物的抗氧化性研究

［6］的方法，在10.00mL具塞试管中加入1mL 0.75moL/L邻二氮菲溶液，2.00mL 0.2 moL/L、pH7.4磷酸盐缓冲溶液和蒸馏水1.00mL，充分摇匀，再加入0.75moL/LFeSO4溶液，摇匀后加入1.00mL3%双氧水启动反应，37℃水浴1 h后在510 nm处测量吸光度A1值，用1.00mL提取液代替1.00 mL双氧水测定吸光度 A2，用提取液1.00mL代替1mL蒸馏水测定吸光度A3值.黄酮类化合物可与Fenton系统中自由基反应，从而阻断其反应链，导致样品吸光度降低，按照实验方法测定吸光度，并计算清除率.

式中:S为清除率(%)，A1为不加样液时的吸光度，A2为不加H2O2时的吸光度，A3为加入H2O2和样液的吸光度.

2 结果与分析

2.1 单因素实验

2.1.1 提取时间对橘皮总黄酮提取得率的影响

准确称取1.00 g橘皮粉置于锥形瓶，固定乙醇浓度为60%，液料比为20∶1，超声波功率为125 W，浸取20，30，40，50，60，70min后，分别吸取提取液1.00mL，其他条件参照1.3.1进行实验，以不加入提取液为空白溶液，结果见图1.

图1 提取时间对橘皮总黄酮提取得率的影响Fig.1 Effect time on extraction of total flavonoid from orange peel

由图1可知在20～50min内，随着提取时间的延长，提取得率随时间的延长增大，20～40min黄酮提取得率增加显著.50min之后总黄酮提取得率随时间变化下降，可能是因为橘皮中所含黄酮类物质已基本溶出，所以增加提取时间不能使提取得率升高.另外超声时间长，使得环境温度升高，部分溶剂乙醇挥发从而影响提取效果;温度升高，蛋白质及杂质沉淀下来，影响黄酮类物质的溶出，另一方面温度升高也导致提取液中有效成分破坏，黄酮分解.所以选择最佳提取时间为50min.

2.1.2 液料比对橘皮总黄酮提取得率的影响

准确提取处理好的橘皮粉1.00 g，在60%的乙醇，超声波功率为125W，提取时间为50min的条件下，选取液料比分别为10∶1，20∶1，30∶1，40∶1，50∶1，60∶1ml/g，研究液料比对橘皮粉总黄酮提取得率的影响，分别吸取提取液1.00mL，其他条件参照1.3.1进行实验，以不加入提取液为空白溶液，结果见图2.

图2 液料比对橘皮总黄酮提取率的影响Fig.2 Effect of liquid-solid ratio on extraction of total flavonoid from orange peel

由图2可以看出，液料比不断增大，总黄酮提取得率呈现逐渐增大趋势，其原因可能是液料比增大，系统稀释度就增大，有利于黄酮的溶出，液料比的提高主要是增加了物料体系与提取剂体系间有效成分的浓度差，也减少了物料内部有效成分的残余量，从而提高提取得率.在液料比为50∶1后继续增加液料比，得率有下降的趋势.所以选择50∶1为最佳液料比.

2.1.3 乙醇浓度对橘皮总黄酮提取得率的影响

准确称取1.00 g橘皮粉，在超声波功率为125 W、提取时间为50min、液料比为50∶1的条件下，选择乙醇浓度分别为40%，50%，60%，70%，80%，90%，研究乙醇浓度对橘皮粉黄酮提取率的影响.分别吸取提取液1.00 mL，其他条件参照1.3.1进行实验，以不加入提取液为空白溶液，结果见图3.

由图3可知，随着乙醇浓度的增加，橘皮中总黄酮提取得率出现先增高后基本处于稳定，变化不明显.因为乙醇浓度提高，增加了提取剂对物料的渗透性，并提高了黄酮类化合物的溶解度，从而提高黄酮提取得率.下降的原因可能是由于乙醇浓度过高时，挥发严重，同时一些醇溶性杂质、色素、脂溶性强的成分溶出量增加，与黄酮类化合物竞争与乙醇结合，因而导致提取得率略有下降.所以乙醇最佳浓度为70%.

图3 乙醇浓度对橘皮总黄酮提取得率的影响Fig.3 Effect of concentration of alcoholon extraction of total flavonoid from orange peel

2.1.4 超声功率对橘皮总黄酮提取得率的影响

准确称取1.00g橘皮粉，在提取时间为50min、液料比为50∶1、乙醇浓度为70%的条件下，选择超声波功率分别为125，150，175，200，225，250W，研究超声波功率对橘皮粉黄酮提取得率的影响.分别吸取提取液1.00mL，其他条件参照1.3.1进行实验，以不加入提取液为空白溶液，结果见图4.

图4 超声功率对橘皮总黄酮提取率的影响Fig.4 Effect of ultrasonic power of total flavonoid from orange peel

由图4可知，随着超声功率的增加，总黄酮提取得率逐渐增大，慢慢趋于平衡.由于实验设备最大超声功率为250W，实验选250W为超声功率，并且在后面的响应面法优化提取工艺不予考虑.

2.2 响应面优化分析

在单因素实验基础上，固定超声波功率为250 W，以乙醇体积分数、提取时间和液料比为自变量，橘皮中总黄酮提取得率为响应值(Y)，响应面实验因素与水平见表1，实验分析结果见表2.

表1 响应面实验因素与水平Table1 Factors and levels of response surface(RS)test

实验随机次序进行，利用 Design－ExpertV8.0.6软件对数据进行多元回归拟合，得到总黄酮提取得率Y为目标函数:

表2 响应面及实验分析结果Table2 Program and results of RS test

表3 回归分析结果Table3 Statistical results of regression analysis

表4 模型可信度分析表Table4 Fit statistics for Y

回归方程中各变量对响应值影响的显著性用F检验来判定，概率P(F＞Fα)值越小，则相应变量的显著程度越高，P(F＞Fα)＜0.01时影响为高度显著.表3中模型的F值为183.86，P值为小于0.0001，说明模型回归高度显著.失拟性P值为0.1376，大于0.05，表示失拟性不显著，说明该模型是合理的.B，C，A2，B2，C2的P值均小于0.05，对总黄酮的提取率影响显著.模型调整后决定系数R=0.9904，说明模型能解释99.04的响应值变化，仅有总变异的0.96%不能用此模型解释;信噪比(Adeq-Precision)=37.621＞4，说明方程的拟合度和可信度均较高，可用于预测反应的分离度.C.V./%(Y的变异系数)表示试验的精确度，C.V./%值越高，说明试验的可靠性越低.该试验中C.V.=0.55%，说明试验操作可信.综合分析该模型拟合程度良好，可以用来分析和预测橘皮总黄酮提取的最佳操作条件.

图5～7是通过多元回归方程所做的响应曲面图及其等高线图，所拟合的响应曲面和等高线能比较直观地反应各因素间的互交作用.

图5 Y=f(A，B)的响应面和等高线Fig.5 Responsive surfaces and contours of Y=f(A，B)

图6 Y=f(B，C)的响应面和等高线Fig.6 Responsive surfaces and contours of Y=f(B，C)

图7 Y=f(A，C)的响应面和等高线Fig.7 Responsive surfaces and contours of Y=f(A，C)

由图5～7直观地反映了各因素对响应值的影响，等高线均在－1～1范围内，3个响应曲面均为开口向下并有最高点，说明响应值(橘皮总黄酮提取得率)最大值在设计的范围之内.由Design－ExpertV8.0.6软件分析得到最佳提取条件为乙醇体积分数为71.78%，液料比为48.92∶1，提取时间为50.2min，理论总黄酮提取率为1.51%.为实验操作方便，总黄酮提取优化工艺参数选为乙醇体积分数72%，液料比为50∶1，提取时间为50min.在此条件下进行6次平行试验，橘皮中总黄酮平均提取得率是1.50%，与理论值相差0.01%，由此可知，响应面优化橘皮总黄酮提取工艺参数准确，具有实际可操作性.

2.3 橘皮中总黄酮的抗氧化性

橘皮总黄酮对羟基自由基的清除效果如图8.不同浓度的橘皮黄酮对该体系中产生的·OH均有一定的清除作用，并且随着总黄酮浓度的增加，对羟基自由基的清除能力增强;浓度相同时，总黄酮清除羟基自由基活性能力略高于Vc.

图8 橘皮总黄酮对·OH自由基的清除作用Fig.8 ·OH scavenging effects of total flavonoid from orange peel

3 结论

本实验在单因素实验的基础上，采用响应面试验设计方法对超声波辅助乙醇提取橘皮总黄酮的工艺进行优化.实验得到的模型回归显著，失拟误差不显著，说明通过本实验所建立的二次回归方程能较好地描述各因素和响应值之间的关系.应用Design－Expert软件分析得到橘皮总黄酮提取的最佳提取工艺条件为:乙醇浓度72%、液料比50∶1 mL/g、超声时间50min，在此条件下，实际提取得率最高达1.50%，跟预测值基本一致，说明该模型可很好地预测试验结果.橘皮中总黄酮具有一定的抗氧化作用，其在Fenton体系中对羟基自由基的清除率大于同浓度的Vc.

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