王坤林 崔琴 常毅娜 孙妍 郭雯 付真真 曹国庆 杨涛 周红文

口服他汀类药物对2型糖尿病患者血清前蛋白转化酶枯草溶菌素9水平的影响

王坤林 崔琴 常毅娜 孙妍 郭雯 付真真 曹国庆 杨涛 周红文

目的探讨2型糖尿病患者在服用他汀类药物进行降脂治疗的过程中血清前蛋白转化酶枯草溶菌素9（PCSK9）水平的变化情况。方法采用随机抽样的方法，分别收集31例临床上需要服用他汀类药物进行降脂治疗的2型糖尿病患者用药前和用药4周后的空腹血标本。对入选者进行病史采集、体格检查以及血清生化指标等的检测。采用双抗夹心ELISA的方法检测患者服药前后血清PCSK9的水平。结果他汀类药物能显著降低2型糖尿病患者血清TC、LDL⁃C、TG等的水平（P＜0.01）。口服他汀类药物治疗后2型糖尿病患者的血清PC⁃SK9水平与治疗前相比明显增加，差异有统计学意义（P＜0.01）。结论他汀类药物的使用可以升高2型糖尿病患者血清PCSK9的水平，并在一定程度上影响他汀的降脂效果。

前蛋白转化酶枯草溶菌素9；低密度脂蛋白胆固醇；他汀类药物

临床上，他汀类药物作为2型糖尿病人群预防动脉粥样硬化相关的大血管病变的一线调脂药物，其主要作用机制是通过上调细胞表面低密度脂蛋白受体（low⁃density lipoprotein receptor，LDLR）的数目来降低血清胆固醇的水平。虽然目前他汀类药物的临床应用极其广泛，但它仍然有一定的局限性。不仅因为其可能带来的一些不良反应（如肝脏、肌肉等的损害），而且对于一些患者单用他汀类药物其降脂效果往往不够理想，即使加大他汀类药物的使用剂量其降脂能力也只能增加6%左右［1］。因此，对他汀6%法则机制的探索以及寻找并研发出新型的调脂药物一直是人们研究的方向。

近年来，人们发现一种叫做前蛋白转化酶枯草溶菌素9（proprotein convertase subtilisin／kexin type 9，PCSK9）的蛋白分子可以通过受体介导的内吞作用导致细胞表面LDLR降解增加，细胞摄取血浆中低密度脂蛋白胆固醇（low density lipoprotein cholestero，LDL⁃C）的能力下降，进而使得血浆中LDL⁃C水平升高［2⁃3］。他汀类药物在上调细胞表面LDLR表达的同时是否会带来血清PCSK9水平的增加，从而在一定程度上降低了他汀类药物的降脂效果，尚不明确。为此，本文对31例口服他汀类药物的2型糖尿病患者进行了4周的随访研究，探讨他汀治疗前后血清PCSK9水平的变化情况。

1 资料与方法

1.1 研究人群 随机抽取2011年南京医科大学第一附属医院内分泌科需要使用他汀类药物进行降脂治疗的住院2型糖尿病患者31例。男17例，女14例，年龄41～69岁，平均（60±8）岁，体质量指数（BMI）为22.7～34.8，平均29.8±6.0，临床上均有给予他汀类药物进行降脂治疗的指征，且无他汀类药物使用的禁忌证。在31例随访的患者中，口服氟伐他汀40 mg治疗4周者共有19例，口服阿托伐他汀20 mg治疗4周者共有12例。

1.2 研究方法

1.2.1 签订知情同意书：与入选人群进行沟通，告知其本研究的目的、方法、预期的结果以及意义；告知其参加本研究后可能带来的益处、风险和不适；告知其在参与本研究过程中需要配合的项目。患者了解上述内容并表示同意后与其签订知情同意书。

1.2.2 相关问卷调查：采用统一设计的流行病学调查表，内容主要包括一般情况、饮食和生活习惯、既往病史、家族史和药物服用史等。

1.2.3 标本的采集及血清脂质的测定：经静脉留取研究对象的空腹血置于促凝管中，4℃保存直至离心（2000 r／min，15 min），分离血清并分装保存于－80℃冰箱。血脂、肝功能等均由南京医科大学第一附属医院检验中心专业检验人员进行检测，使用仪器为全自动生化分析仪（Hitachi7020），其中血清脂质成分包括总胆固醇（TC）、三酰甘油（TG）、高密度脂蛋白胆固醇（HDL⁃C）和LDL⁃C等均通过酶法定量。

1.2.4 随访：告知入选者从服用他汀类药物进行性降脂治疗的第1天算起至服药后的第4周，来医院采血检测肝功能以及血脂等指标，另由研究者抽取一管促凝血分离血清后检测其PCSK9水平。随访过程中患者如出现严重的肝功能异常应嘱其停用他汀类降脂药物，并在内分泌专科医师的指导下改用其他治疗方案。本临床研究中主要使用的他汀类降脂药物为氟伐他汀（来适可）和阿托伐他汀（立普妥），服用的方法分别为40 mg，每晚1次和20 mg，每晚1次。

1.2.5 PCSK9的检测：利用双抗夹心ELISA方法检测血清PCSK9水平，相关抗体由美国礼来公司研究室提供［4⁃5］。具体步骤如下：（1）用缓冲液稀释anti⁃PCSK9⁃B9抗体至一定浓度，在酶标板的反应孔中各加入100μl，4℃过夜；（2）弃去孔内液体，TBST液洗板后加入封闭液，室温下反应1 h；（3）用含1%BSA的分析液依次倍比稀释PCSK9标准品，并用配制好的分析液处理血样本，洗板后依次加入酶标板各反应孔中，室温下孵育1.5 h；（4）弃去孔内液体，洗板后用含0.1%BSA的分析液稀释HRP标记的抗体（anti⁃PCSK9⁃A4抗体），加入各反应孔中，室温下反应1 h；（5）于各反应孔中加入TMB底物溶液（Pierce）进行显色反应，室温下避光10～30 min，待肉眼可见标准品的各孔呈现有明显的梯度蓝色时即可终止；（6）终止时依次每孔加入100μl的终止液，轻轻混匀30 s，终止反应，此时蓝色转为黄色；（7）反应终止后立即将酶标板置于酶标仪（CliniBio 128）上于450 nm波长检测各孔的光密度值（OD值）；（8）根据标准品的OD值绘制标准曲线，然后计算出血样本的PCSK9值。

1.3 统计学方法 采用Epidata进行数据录入，采用SPSS 17.0进行统计分析，计量资料以均数±标准差（s）表示。服用他汀类药物前后血清脂质水平的变化、肝功能的变化以及PCSK9水平之间的比较采用自身配对t检验。所有统计检验均为双侧概率检验，P＜0.05为有统计学意义。

2 结果

2.1 降脂治疗前后血脂以及肝功能的变化情况 全组治疗的2型糖尿病患者在他汀类药物降脂治疗后血清TC、LDL⁃C、TG均显著降低（P＜0.01），血清HDL⁃C水平则无明显改变。全组患者在使用他汀类药物治疗的过程中没有出现明显的肝功能异常。氟伐他汀与阿托伐他汀治疗前后患者血清当中丙氨酸氨基转移酶（ALT）和天冬氨酸氨基转移酶（AST）的水平均无明显统计学差异（P＞0.05）（表1，2）。

2.2 他汀类药物治疗前后血清PCSK9水平的变化情况 全组治疗后血清PCSK9水平增加了26.4%；氟伐他汀组治疗后血清PCSK9水平增加了26.8%；阿托伐他汀组治疗后血清PCSK9水平增加了25.9%。2组患者治疗后的血清PCSK9水平与治疗前相比均有明显的统计学差异（P＜0.01）（表1，2）。

表1 全组治疗前后脂代谢相关指标的变化情况（n＝31，s）

表1 全组治疗前后脂代谢相关指标的变化情况（n＝31，s）

注：与治疗前比较，∗∗P＜0.01

指标治疗前治疗4周TC（mmol／L）5.93±0.71 3.80±0.44∗∗LDL⁃C（mmol／L）4.12±0.62 2.45±0.39∗∗TG（mmol／L）1.93±0.93 1.46±0.52∗∗HDL⁃C（mmol／L）1.03±0.19 0.99±0.23 ALT（U／L）20.8±8.9 24.8±13.8 AST（U／L）25.6±10.0 27.0±13.1 PCSK9（ng／m l）86.87±18.31 109.82±22.66∗∗

表2 2组治疗前后脂代谢相关指标的变化情况（s）

表2 2组治疗前后脂代谢相关指标的变化情况（s）

注：与治疗前比较，∗P＜0.05，∗∗P＜0.01

氟伐他汀组（n＝19）指标阿托伐他汀组（n＝12）治疗前治疗4周治疗前治疗4周TC（mmol／L）5.92±0.76 3.88±0.41∗∗5.95±0.66 3.68±0.46∗∗LDL⁃C（mmol／L）4.07±0.64 2.43±0.44∗∗4.19±0.60 2.47±0.44∗∗TG（mmol／L）1.92±1.06 1.37±0.40∗1.94±0.70 1.6±0.67∗∗HDL⁃C（mmol／L）1.03±0.20 0.95±0.26 1.03±0.19 1.06±0.17 ALT（U／L）20.4±8.3 26.7±16.3 21.4±10.1 21.9±8.4 AST（U／L）26.0±11.4 29.3±15.7 24.9±7.9 23.3±6.5 PCSK9（ng／ml）79.68±12.47 101.07±17.67∗∗98.26±20.71 123.68±23.41∗∗

2.3 随访情况 对31例随访者中依从性较好的2例患者进行了长达16周的随访。在患者服药期间，嘱咐其每隔4周来医院抽血检测1次血脂，并采其空腹血检查血清PCSK9的水平。结果发现口服氟伐他汀40 mg进行治疗和服用阿托伐他汀20 mg进行治疗后，2例患者的血清TC、LDL⁃C水平在0～4周内有明显的下降，然而随着治疗时间的延长（4～16周），患者体内TC、LDL⁃C的水平则一直维持在较低水平，没有更进一步的降低（TC分别维持在3.89 mmol／L和3.2 mmol／L左右，LDL⁃C分别维持在2.80mmol／L和2.10 mmol／L左右）。2例患者的血清PCSK9水平也在降脂治疗的前4周内有明显的提高，而随着治疗时间的延长，血清PCSK9水平则一直维持在较高水平，没有更进一步的升高（PCSK9分别维持在100.00 ng／ml和130.00 ng／ml左右）。

3 讨论

血脂异常，尤其是胆固醇水平的异常是引起2型糖尿病患者动脉粥样硬化的最主要因素，已被大量的流行病学研究和前瞻性随机临床试验的结果所证实。合理使用降脂药物，降低血清胆固醇水平对动脉粥样硬化相关并发症的防治具有重大意义。目前临床上使用的调脂药物大致可以分为以下几类：他汀类调脂药、贝特类降脂药、烟酸类降脂药以及其他类降脂药。他汀类药物作为目前临床上降低LDL⁃C水平的一线药物，其调脂机制主要是通过竞争性抑制HMG⁃CoA还原酶的合成，反馈性刺激肝细胞表面LDLR的数目增加，从而加速摄取血浆中的LDL⁃C。

近年来的研究发现，在使用他汀类药物进行调脂治疗的过程中，可伴有一定程度血清PCSK9水平的升高，并且其升高的程度与他汀类药物的种类、使用剂量的大小以及治疗时间的长短均有一定的关系。Dubuc等［6］进行的体外研究显示，运用不同种类的他汀类药物对HepG2肝癌细胞株进行处理后，细胞内PCSK9 mRNA的表达量显著增加。并且发现，在给予不同剂量的阿托伐他汀处理后（0.01～10μmol／L），细胞表达LDLRmRNA和PCSK9mRNA的量都随着阿托伐他汀处理剂量的增加而增加。Careskey等［7］对12例高胆固醇血症的患者给予40mg／d的大剂量的阿托伐他汀治疗16周后发现，患者血清LDL⁃C的水平下降了42%的同时血清PCSK9的水平则升高了34%。本研究对入院后开始使用他汀类药物进行降脂治疗的2型糖尿病患者进行了4周的随访研究，结果证明在运用他汀类药物进行降脂治疗前后，其血清TC、LDL⁃C水平下降的同时伴有血清PCSK9水平的显著升高，且升高的比率达26.4%，其中氟伐他汀治疗组和阿托伐他汀治疗组血清PCSK9分别增加了26.8%和25.9%。此外，我们还对2例分别服用氟伐他汀40 mg／d和阿托伐他汀20 mg／d的患者进行了16周的随访研究，结果发现，在他汀类药物治疗的前4周，其血清TC、LDL⁃C的水平有较大幅度的下降，而在治疗的第4～16周时间内，其血清TC、LDL⁃C并没有更进一步的下降，而维持在一个较低的水平。与此同时，其血清PCSK9的水平在前4周也大幅度上升，而随着TC、LDL⁃C水平的稳定，在治疗的后12周内其血清PCSK9水平也一直维持在一个较高的水平。这一结果与Welder等［8］研究相类似。由于大量的体内体外研究已经证明，血清PCSK9可以通过受体介导的内吞作用降低细胞表面LDLR的数目进而调节体内胆固醇的代谢，然而临床上他汀类药物主要是通过升高LDLR的数目来降低血清当中胆固醇的水平。因此，他汀类药物在升高LDLR的过程中可能反馈性的使得PCSK9的表达增加从而产生了一定的拮抗作用。这可能在一定程度上解释了为什么在临床实践中他汀类药物剂量加倍时其降脂能力只能增加6%左右。

鉴于最近几年来的研究结果，人们发现既然PCSK9能够使得LDLR受体降解增加从而导致血清胆固醇水平升高，那么PCSK9抑制剂能否阻断这一作用途径，从而成为一种新型的有效的临床调脂药物？目前，已有大量的学者把目光聚焦在了基于以PCSK9为靶点的药物研究与研发当中。并且在动物实验中已经证实，与PCSK9相关的抑制剂确实能够降低血清中胆固醇的水平。有研究发现，给转入人PCSK9基因的小鼠静脉注射一定剂量的小分子干扰RNA（small in⁃terfering RNA，SiRNA）来降低小鼠体内PCSK9 mRNA的水平，结果发现其血清中的胆固醇水平有明显的下降［8］。Gupta等［9］运用一种LNA的反义寡核苷酸（其能够抑制PCSK9 mRNA的合成）对HepG2和HuH7肝癌细胞株以及小鼠的原代肝细胞进行处理后发现在血清PCSK9水平下降的同时，小鼠体内的胆固醇水平也有显著的下降。这些研究结果都在一定程度上说明，PCSK9抑制剂有望作为新型的降脂药物参与脂代谢相关性疾病的治疗。对于那些不能使用现有的调脂药物进行治疗的患者，PCSK9抑制剂在不久的将来可能会给他们提供一个新的治疗选择。此外，鉴于他汀类药物的调脂机制，他汀类药物联合PCSK9抑制剂的运用将对那些顽固性的高胆固醇血症患者带来更强的临床降脂效果。

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Effect of statins on the serum levelof PCSK 9 in the patientsw ith type 2 diabetesmellitus

WANGKun⁃lin，CUIQin，CHANG Yi⁃na，SUN Yan，GUOWen，FU Zhen⁃zhen，CAO Guo⁃qing，YANG Tao，ZHOU Hong⁃wen．Department of Endocrino⁃logy，the First Affiliated Hospital ofNanjing Medical University，Nanjing 210029，China

ObjectiveTo investigate the effects of statins on the levels of serum PCSK9 in the patientswith type 2 diabetesmellitus.M ethodsFasting blood samples were obtained from 31 patients with type 2 diabetesmellitus before and after 4 weeks'statins therapy.All patients received disease history collection，physical and biochemical examinations. The serum level of PCSK9 wasmeasured with a sensitive and specific sandwich ELISA.ResultsAfter statin therapy，the levels of TC，LDL⁃C，TG were obviously decreased（P＜0.01），and the levels of serum PCSK9 was significantly increased（P＜0.01）.ConclusionsStatins can significantly enhance the serum level of PCSK9.PCSK9 inhibitorswould be a new⁃ly promising lipid⁃lowering drug.

proprotein convertase subtilisin／kexin type 9；low density lipoprotein cholesterol；statins

R 587.1

A

10.3969／j.issn.1003⁃9198.2014.03.020

2013⁃08⁃28）

国家自然科学基金资助项目（81170747）；江苏省兴卫工程医学重点人才（H201106）；江苏省六大人才高峰（2008⁃18D）

210029江苏省南京市，南京医科大学第一附属医院内分泌科

周红文，Email：drhongwenzhou＠gmail.com