徐丽香 王作镇 舒正玉 武海龙 刘艳如 李欣 黄建忠

（1. 福建师范大学工业微生物发酵技术国家地方联合工程研究中心，福州 350108；2. 福建师范大学教育部工业微生物工程中心，福州 350108；3. 福建师范大学生命科学学院，福州 350108）

细菌脂肪酶在大肠杆菌细胞表面的功能性展示

徐丽香 王作镇 舒正玉 武海龙 刘艳如 李欣 黄建忠

（1. 福建师范大学工业微生物发酵技术国家地方联合工程研究中心，福州 350108；2. 福建师范大学教育部工业微生物工程中心，福州 350108；3. 福建师范大学生命科学学院，福州 350108）

细胞表面展示技术已广泛应用于突变文库的高通量筛选，有力地促进了蛋白质工程的发展。以来自于铜绿假单胞菌的自转运蛋白Est A的羧基端结构域作为锚定区，构建脂肪酶LipA与EstA羧基端结构域的融合基因，并将融合基因插入到改造后的pACYC-Duet表达载体中，获得表面展示载体pBCCB-X1。将载体pBCCB-X1分别导入到大肠杆菌JK321和大肠杆菌UT5600菌株中，以IPTG诱导融合基因的表达。分别用三丁酸甘油酯定性检测和pNPO定量检测诱导表达后的全细胞脂肪酶的水解活性。试验结果表明，脂肪酶LipA在大肠杆菌JK321和大肠杆菌UT5600细胞表面均得到功能性展示，水解活性分别为（2.8±0.1）U/OD和（2.6±0.06）U/OD。脂肪酶LipA在大肠杆菌细胞表面的功能性展示，为后续高通量筛选LipA突变基因文库，奠定了坚实的基础。

大肠杆菌 细胞表面展示 脂肪酶A 枯草芽胞杆菌

脂肪酶，又称三酰甘油酯水解酶（Triacylglycerol lipase，EC3.1.1.3），能有效地催化各种底物的酯解反应。作为一种非水相酶，脂肪酶在各种有机体系（无水体系或微水体系）中，还能高效催化醇解反应、氨解反应及转酯反应等多种反应。作为一种重要的工业生物催化剂，脂肪酶已被广泛应用于食品工业、去污剂、油脂深加工、手性药物合成等领域［1，2］。

在已知的各种脂肪酶资源中，来自于枯草芽胞杆菌（Bacillus subtilis）的脂肪酶LipA具有独特的结构特点和催化活性，已引起学界和业界的广泛关注。该脂肪酶的3D结构不具有大多数微生物脂肪酶结构所具有的盖子结构域（Lid domain），因此并

不表现出大多数脂肪酶所具有的界面激活（Interfacial activation）的催化特性［3］；在其3D结构中，也没有二硫键，因此耐受各类氧化剂的能力较其他脂肪酶更高。近年来，尽管利用蛋白质工程技术改造枯草芽胞杆菌脂肪酶LipA已获得巨大的成功［4］，但依然存在许多技术性障碍。例如，如何建立枯草芽胞杆菌的高效转化体系［5，6］，如何对突变基因文库实现高通量筛选等问题，制约了对该脂肪酶的进一步深入分子改造。

细胞表面展示技术（Cell surface display）是利用运载蛋白，将靶蛋白展示在宿主细胞表面的蛋白质技术。基于细胞表面展示技术发展出的荧光激活细胞分选法（Fluorescence-activated cell sorting，FACS）等超高通量筛选技术，已成功应用于对酶分子定向突变进化文库的筛选工作，并取得良好的效果［7，8］。在已发展出的各种细胞表面展示系统中，大肠杆菌（Escherichia coli）细胞表面展示系统，因其遗传背景清晰，遗传操作简单，因此成为各种靶蛋白展示的首选展示系统。到目前为止，来自于荧光假单胞菌（Pseudomonas fluorescens）脂肪酶、芽胞杆菌属（Bacillussp.）脂肪酶、南极假丝酵母（Candida antarctica）脂肪酶B等已在大肠杆菌细胞表面实现功能性展示［9-11］。如何实现具有较大分子量的酶分子的高效功能性展示及共展示不同酶分子，获得具有多种催化活性的全细胞催化剂，从而将多步催化反应偶联起来，是大肠杆菌细胞表面展示系统研究的热点［12-14］。本研究以来自于铜绿假单胞菌（Pseudomonas aeruginosa）的自转运蛋白Est A作为运载蛋白，成功地将枯草芽胞杆菌脂肪酶LipA展示到大肠杆菌细胞的表面，为后续利用蛋白质工程技术改造在脂肪酶LipA奠定了基础。

1 材料与方法

1.1 材料

本试验中使用及构建的质粒及菌株见表1。质粒pMD18-T simple、各种限制性内切酶、T4DNA连接酶、DNA marker及LA Taq DNA聚合酶等购自大连TaKaRa宝生物公司；SanPrep质粒小量抽提试剂盒购自生工生物工程（上海）股份有限公司；琼脂糖凝胶回收试剂盒购自天根生化科技（北京）有限公司；各类抗生素购自鼎国昌盛生物技术有限责任公司（福州），其使用浓度分别为：氨苄青霉素，40 μg/mL；氯霉素，50 μg/mL；三丁酸甘油酯购自国药公司；对硝基苯酚辛酸酯（4-Nitrophenyl octanoate，pNPO）购自 Sigma 公司；其他常规试剂均为市售分析纯。

表1 本试验使用的菌株及质粒

1.2 方法

1.2.1 细胞表面展示质粒pBCMB-X1的构建 用于大肠杆菌细胞表面功能性展示枯草芽胞杆菌胞外脂肪酶LipA的重组质粒pBCMB-X1的构建流程，如图1。构建该重组质粒使用的引物、引物的Tm值及其携带的限制性内切酶识别位点，见表2。试验过程中，PCR扩增反应使用的引物、模板、PCR扩增条件及其扩增产物大小，见表3。具体构建过程如下：以质粒pUC19为模板，以lacZ PF和lacZ PR为引物对，PCR扩增lacZ的启动子。PCR扩增条件及扩增产物大小，见表3。PCR扩增产物和质粒pACYCDuet分

别用限制性内切酶EcoNⅠ和NcoⅠ酶切。酶切产物纯化后，用T4DNA连接酶连接；连接产物转化E. coliDH5α；以氯霉素抗性平板筛选转化子，抽提并酶切验证重组质粒pBCMB-W1。验证后的重组质粒，送交生工生物工程（上海）股份有限公司测序，进一步验证该质粒的正确性。

图1 细胞表面展示质粒pBCMB-X1构建流程图

表2 本试验中使用的PCR引物

表3 本试验PCR扩增条件及其产物

以枯草芽胞杆菌的基因组为模板，以lipA CF和lipA CR为引物对，PCR扩增lipA基因。PCR扩增条件及扩增产物大小，见表3。PCR扩增产物纯化后，克隆到pMD18-T Simple中，转化E. coliDH5α。以氨苄青霉素筛选转化子，抽提并PCR验证重组质粒pMD18-T-lipA。验证后的重组质粒，送交生工生物工程（上海）股份有限公司测序。

本课题组先前已克隆完整的铜绿假单胞菌自转运蛋白EstA编码基因（NCBI核酸数据库登录号为JN601114）。以铜绿假单胞菌AFU01菌株基因组DNA为模板，以estA EF / estA ER为引物对，PCR扩增estA'基因片段。PCR扩增条件及扩增产物大小，见表3。

先以枯草芽胞杆菌的基因组为模板，以lipA EF和lipA ER为引物对，PCR扩增lipA基因。PCR扩增条件及扩增产物大小，见表3。纯化后的PCR扩增产物lipA与estA'片段按照一定的比例混合，并以此混合物为模板，以lipA EF / estA ER为引物对，PCR扩增lipA-estA'融合基因片段。PCR扩增条件及扩增产物大小，见表3。

分别用限制性内切酶BamHⅠ和Hind III对lipA-estA'融合基因片段及质粒pBCMB-W1进行酶切。纯化后的酶切产物再按一定的比例混合，用T4DNA连接酶连接。连接产物转化E. coliDH5α。以氯霉素抗性平板筛选转化子，抽提并酶切验证、PCR验证重组质粒pBCMB-X1。验证后的重组质粒pBCMB-X1进一步送交生工生物工程（上海）股份有限公司测序验证。

1.2.2 脂肪酶lipA的诱导表达 将测序验证正确的重组质粒pBCMB-X1和pBCMB-W1分别转化到大肠杆菌E. coliJK321和E.coliUT5600菌株中，氯霉素抗性平板筛选转化子。37℃过夜培养，从平板上分别挑取单菌落接种于含有50 μg/mL的氯霉素的LB液体培养基中，37℃ 220 r/min振荡培养。当培养物菌体密度OD600达到0.6时，向培养基中加入IPTG至终浓度为1 mmol/L。30℃ 200 r/min诱导lipA基因表达。12 h后4 000 r/min离心培养物，去掉上清，收集菌体。菌体再用20 mmol/L的磷酸缓冲液（pH7.4）洗涤2次，并重悬在相同的缓冲溶液中，4℃保存。1.2.3 细胞表面展示脂肪酶酶活的定性与定量测定 细胞表面展示脂肪酶酶活的平板定性检测方法参照Hiol 等［16］的平板检测方法并略作修改。用于定性检测的LB固体培养基中同时添加有1 mmol/L IPTG，50 μg/mL 氯霉素和3%（V/W）的三丁酸甘油酯乳化液。分别将4种转化子E. coliJK321-pBCMBX1、E. coliJK321-pBCMB-W1、E. coliUT5600-pBCMB-W1、E. coliUT5600-pBCMB-X1的单菌落点接到定性检测平板上，37℃培养2 d后观察水解圈的产生情况。

细胞表面展示脂肪酶酶活的定量测定采用比色法，参照Kordel 等［17］的检测方法，并略作修改。首先分别测定材料与方法1.2.2部分收集的菌悬液的OD600值。然后取150 μL菌悬液加入到2 820 μL 20 mmol/L pH7.4的磷酸缓冲液中，同时向反应体系中加入30 μL 2.5 mmol/L的对硝基苯辛酸酯。37℃反应5 min后，离心收集上清液，测定其OD410值。酶活单位定义为：在该反应条件下，每分钟释放出1 μmol 对硝基苯酚所需要的酶量（OD600）作为1个酶活单位（U/OD600）。

2 结果

2.1 枯草芽胞杆菌脂肪酶基因的克隆与序列分析

从枯草芽胞杆菌YU01菌株克隆出的脂肪酶lipA基因，已提交NCBI核酸数据库，登录号为JX048066。该基因全长为639 bp，编码212个氨基酸残基。与其他已得到功能验证或结构解析的枯草芽胞杆菌脂肪酶LipA（如图2中1I6W，2QXT和1T4M等）具有高度的同源性。比对结果（图2）表明，Ser108、Asp164和His187构成了LipA的催化三联体，并且Ser108位于保守五肽（Ala-His-Ser-Met-Gly）中。

2.2 枯草芽胞杆菌脂肪酶表面展示载体的构建

构建完成后的细胞表面展示载体pBCMB-X1质粒结构，如图3-A。较初始质粒pACYCDuet而言，pBCMB-X1质粒的启动子变更为lacZ启动子，同时在其多克隆位点MCS1处插入了lipA与estA'的融合基因。启动子调控区、靶蛋白、运载蛋白编码区测序结果， 如图3-B。 测序结果表明， 编码区序列正确。

2.3 细胞表面展示脂肪酶酶活的测定

细胞表面展示脂肪酶定性检测结果，如图4-A。携带有融合基因的E. coliUT5600-pBCMB-X1（菌

落3）和E. coliJK321-pBCMB-X1（菌落4）较对照菌株E. coliUT5600-pBCMB-W1（菌落1）和E. coliJK-321-pBCMB-W1（菌落2）而言，菌落周围有明显的水解圈，表明该菌株能产生具有活性的脂肪酶。进一步利用对硝基苯酚辛酸酯作为底物进行定性测定结果表明，E. coliJK321-pBCMB-X1和E. coliUT5600-pBCMB-X1的酶活分别为（2.8±0.1）U/OD和（2.6±0.06）U/OD。

图2 枯草芽胞杆菌脂肪酶LipA的氨基酸序列与其他LipA的氨基酸序列比对

图3 细胞表面展示载体pBCMB-X1结构示意图（A）及其序列分析图（B）

图4 细胞表面展示脂肪酶酶活的定性分析（A）及定量测定（B）

3 讨论

本研究通过改造低拷贝数质粒pACYCDuet成功实现枯草芽胞杆菌脂肪酶LipA在大肠杆菌细胞表面的功能性展示。在前期试验中，我们曾尝试利用pHSG398功能性展示LipA，但试验未能成功，推测pHSG398为pMB1复制子，该质粒为高拷贝数质粒，而外源靶蛋白的大量表达对受体菌的生长可能具有一定的消极影响，从而导致表面展示试验的失败［18］。在后续试验中，我们选用低拷贝数的pACYCDuet质粒（复制子为P15A）作为原始出发质粒，构建细胞表面展示载体。然而，pACYCDuet质粒使用T7启动子，为强诱导型启动子，因此在展示靶蛋白LipA之前，先将pACYCDuet质粒第一个多克隆位点的启动子置换为lacZ启动子。试验结果表明，通过降低质粒拷贝数，启用弱启动子等途径降低靶蛋白的表达量，从而实现靶蛋白功能性展示的工作是必要的。

运载蛋白也是影响靶蛋白功能性展示的一个重要因子。本研究选用来自于铜绿假单胞菌的EstA蛋白的羧基端结构域作为锚定靶蛋白的运载蛋白。EstA是定位于细胞外膜并有部分结构域伸展到胞外的自转运蛋白（Autotransporter），其羧基末端具有12个β-折叠形成的β-桶状结构，插入到细胞膜的外膜，形成一个分泌通道［19，20］。基于EstA蛋白的羧基端结构域作为锚定蛋白构建的细胞表面展示系统，已有诸多成功报道［14，21，22］。本试验正是基于这些成功实验结果，直接选用羧基端的β1-β8作为锚定区，实现了LipA的高效功能性表面展示［21］。

受体菌是影响靶蛋白功能性展示的另一个重要因子。本研究比较了E. coliUT5600和E. coliJK321对靶蛋白实现功能性表面展示的影响。试验结果表明，上述两个受体菌展示的LipA的水解活性，未见显著性差异。受体菌E. coliUT5600和E. coliJK321两者之间的唯一差异在于：在E. coliJK321菌株中，影响蛋白质二硫键形成的dsbA基因因插入失活［15］。而本试验被展示的靶蛋白LipA三级结构中，不存在二硫键，推测这是两个受体菌水解活性没有显著性差异的主要原因。

本研究首次报道利用改造后的共展示载体pACYCDuet，在其第一个多克隆位点（MCS1），插入脂肪酶编码基因与自转运蛋白EstA羧基端编码区的融合基因，成功实现脂肪酶A在大肠杆菌细胞表面的功能性展示。为后续在载体的第2个多克隆位点（MCS2）插入其他酶基因（如Amidase，氨解酶）并实现脂肪酶与氨解酶共展示，从而将酯解和氨解两个过程偶联起来，提高手性铵对映体的拆分。

4 结论

本研究以E. coliJK321和E. coliUT5600作为受体菌株，以自转运蛋白Est A的羧基端结构域作为锚定区，利用脂肪酶LipA自身的信号肽介导融合蛋白（脂肪酶与Est A羧基端融合）的分泌，成功地将枯草芽胞杆菌的脂肪酶LipA功能性地展示到受体菌株的表面。展示有脂肪酶LipA的全细胞E. coliJK321和E. coliUT5600对底物对硝基苯酚辛酸酯的水解活性分别为（2.8±0.1）U/OD和 （2.6±0.06）U/OD。

致谢：

感谢西班牙国家生物技术中心的de Lorenzo Víc-

tor 教授及Fernández Luis Angel博士慷慨馈赠本试验使用的E. coliUT5600和E. coliJK321菌株。

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（责任编辑 李楠）

Display of Functionally Active Lipases on the Escherichia coli Cell Surface

Xu Lixiang Wang Zuozhen Shu Zhengyu Wu Hailong Liu Yanru Li Xin Huang Jianzhong
（1. National & Local United Engineering Research Center of Industrial Microbiology and Fermentation Technology，Ministry of Education，Fujian Normal University，Fuzhou 350108；2. Engineering Research Center of Industrial Microbiology，Ministry of Education，Fujian Normal University，Fuzhou 350108；3. College of Life Sciences，Fujian Normal University，Fuzhou 350108）

Cell-surface display technology was used widely in the filed of high throughput screening of a mutant library, which promoted the development of protein engineering. The carboxyl terminal domain of the EstA from Pseudomonas aeruginosa was used as carrier protein and the lipA gene was fused to the estA’ gene by overlap extension PCR. The fusion gene lipA-estA’ was then inserted the genetically modified plasmid pACYC-Duet, which promoter was changed into lacZ promoter. The resulting plasmid pBCMB-X1 was transformed into E. coli JK321 and E. coli UT5600, respectively. The lipA gene was induced expression by IPTG and the recombinant LipA was functionally displayed on the cell surface of E. coli JK321 and E. coli.UT5600, respectively. The hydrolysis activity of the LipA was（2.8±0.1）U/OD and（2.6±0.06）U/ OD, respectively.

Escherichia coli Cell surface display Lipase A Bacillus subtilis

2014-02-12

国家自然科学基金项目（31370802），福建省科技厅重点项目（2013H0021），福建省自然科学基金杰青项目（2009J06013）

徐丽香，女，研究方向：酶工程；E-mail：897787452@qq.com；王作镇同为本文第一作者

舒正玉，男，博士，副教授，研究方向：酶工程；E-mail：shuzhengyu@gmail.com黄建忠，男，博士，教授，研究方向：工业生物技术；E-mail：hjz@fjnu.edu.cn