胡小平 陈办成 邵 勇 张 杰 唐莉华 于 波

IL－9和IL－10基因拷贝数与银屑病发病的相关性

胡小平 陈办成 邵 勇 张 杰 唐莉华 于 波∗

目的: 确定白介素－9(IL－9)和白介素－10(IL－10)基因拷贝数与银屑病发病的相关性。方法: 采用RT－PCR对424例银屑病患者和424名健康者的IL－9和IL－10基因拷贝数变异进行检测和比较。结果: 银屑病患者的IL－9和IL－10基因拷贝数较健康人基因拷贝数显著增高(P＜0.05)。结论: IL－9和IL－10基因拷贝数增加可能会增加对银屑病的易感性。

白介素－9； 白介素－10； 基因拷贝数； 银屑病

银屑病是一种在多基因遗传背景下,由T细胞、树突状细胞和细胞因子共同参与导致的慢性炎症性皮肤病,且细胞因子的平衡失调与该病密切相关。1

基因拷贝数变异(copy number variations,CNVs)是遗传多样性的主要表现形式之一,它可以影响免疫系统,从而增加人类自身免疫性疾病的易感性。2研究发现,CNVs和银屑病严重程度具有明显的相关性。3近年来,细胞因子IL－9和IL－10在银屑病发病中的作用受到关注。目前尚无关于IL－9和IL－10基因拷贝数变异与银屑病发病之间关系的报道,本实验对此进行了初步的研究。

1 材料和方法

1.1 研究对象 银屑病患者组424例(男216例,女208例；年龄2～70岁,平均28.5±12.4岁)来自2008年6月至2012年6月北京大学深圳医院皮肤科门诊,均符合寻常型银屑病的诊断标准。其中进行期患者236例,静止期患者108例,消退期患者80例。健康对照组424名(男220名,女204名；年龄4～65岁,平均28.1±7.8岁)选自同期在北京大学深圳医院健康体检者,无银屑病家族史,无肿瘤、自身免疫性疾病及神经系统疾病等。

1.2 研究方法

1.2.1 DNA提取 抽取424例银屑病患者及424名健康对照者外周静脉血(柠檬酸抗凝)5 m L,3000 rpm分离血细胞,取100μL血细胞,用全血基因组提取试剂盒(由深圳依诺金生物技术有限公司提供)提取基因组DNA。DNA提取步骤如下:向100μL血细胞中加入300μL细胞复合裂解液,混匀器震荡20 s,置65℃水浴中反应20 min。再加入200μL蛋白沉淀液,上下颠倒5～6次使两者混匀,13 000 g离心10 min,将上清转移至新的离心管中,加入等体积异丙醇,混匀后13 000 g离心10 min,倾去上清。最后加入200μL 70%的乙醇溶液,来回倒置清洗管壁, 13 000 g,离心10 min,移去乙醇自然干燥离心管,加入33μL DNA溶解液。用紫外分光光度仪测定DNA纯度及浓度,置于－80℃保存备用。

1.2.2 荧光定量聚合酶链反应(PCR) 运用荧光定量PCR仪扩增待检测的基因片段IL－9和IL－10。选取保守区RNaseP片段作为荧光定量内参标准。

1.2.2.1 引物设计 IL－9引物序列:PF:5′－CTGTGAACAGCCATGCAAC－3′；PR:5′－AAGACTCTTCAGAAATGTCAGC－3′。IL－10引物序列:PF:5′－AAGCTGTTTCCATAGGGTGA－3′；PR:5′－CCAAGCCCAGAGACAAGATA－3′。RNaseP引物序列:5′－ATGTCCCTTGGGAAGATCAG－3′；PR:5′－CTGACCTCAAGCAGCTCTGT－3′。

1.2.2.2 荧光定量PCR扩增 反应总体系10μL,含10mM dNTPmix 0.2μL,Taq Buffer1μL,SYBRGreen (50×)0.1μL,MgCl22.4μL,Taq DNA pol 0.1μL, Primer F(10 nM)0.2μL,Primer R(10 nM)0.2μL,模板DNA 2μL(约10 ng),ddH2O 3.8μL。PCR条件:95℃预变性3 min,1个循环；95℃变性30 s,55℃退火20 s,72℃延伸20 s,读板,共40个循环；溶解曲线温度从65℃～95℃,每升高0.5℃读板1 s,。

1.3 统计学方法 分别统计分析银屑病患者组和健康对照组的IL－9和IL－10基因拷贝数。计数资料比较采用卡方检验,借助SPSS 17.0统计软件分析比较。以α＝0.05为检验水准。基因拷贝数分类参考文献中的方法。4

2 结果

银屑病患者组的IL－9和IL－10基因拷贝数比健康对照组升高,两组拷贝数变异构成比较有显著性差异,均P＜0.05。见表1、2。

银屑病患者组中进行期和消退期患者的IL－9和IL－10基因拷贝数变异构成无显著性差异,均P＞0.05。见表3、4。

表1 银屑病患者与健康对照者IL－9基因拷贝数比较

表2 银屑病患者与健康对照者IL－10基因拷贝数比较

表3 银屑病患者进行期与消退期IL－9基因拷贝数比较

表4 银屑病患者进行期与消退期IL－10基因拷贝数比较

3 讨论

研究发现,IL－9和IL－10主要由一种新型CD4＋T细胞亚群—Th9细胞分泌,在炎症反应及自身免疫性疾病中发挥重要的作用。5在自身免疫性疾病中,IL－9是一种促炎细胞因子,可以使得炎症细胞的数量上升并分泌一些炎症介质,促进炎症的发生。6IL－10是一种抑制炎症的细胞因子,主要通过调节T细胞、B细胞、自然杀伤细胞、抗原提呈细胞、肥大细胞和粒细胞的增殖和分化、抑制Th1细胞分泌干扰素IFN－γ和IL－2来发挥生物学作用,抑制炎症反应的发生。7

IL－9和IL－10在银屑病发病中均具有重要作用。大量研究证实IL－10在银屑病皮损中的表达明显降低是银屑病皮损形成的重要原因,用IL－10相关制剂治疗进行期银屑病可取得明显疗效。9在对IL－ 10启动子多态性的研究中发现,IL－10启动子区包含高度多态性的微卫星等位基因与家族性早年发病的银屑病相关,推测其启动子拷贝数变异与银屑病发病的遗传易感性有关。10

本研究结果显示,银屑病患者组IL－9和IL－10基因拷贝数明显高于健康对照组,两组结果比较有明显差异,说明IL－9和IL－10基因拷贝数变异与银屑病发病有明显的相关性。而对进行期和消退期患者的IL－9和IL－10基因拷贝数变异进行比较显示差异无统计学意义,进一步从不同角度说明IL－9和IL－10基因拷贝数变异增加了罹患银屑病的遗传易感性。本课题组在对白癜风发病相关性分析的研究中发现, IL－9和IL－10基因拷贝数变异与白癜风发病有明显的相关性,11故本研究结果尚不能说明IL－9和IL－10基因拷贝数变异是银屑病发病的遗传特异性因素。

CNVs可能通过直接改变基因的拷贝数来改变一个基因的表达“量”,生成截短蛋白,或者影响基因的调控序列来影响基因的表达,12从而造成个体间表型的差异,包括一些复杂疾病的发生。那么,银屑病患者IL－9和IL－10基因拷贝数变异是否影响了IL－9和IL－10的表达量或其功能的表达,从而促进了银屑病的发生发展,值得深入研究。

总之,基于银屑病是一种多基因遗传背景下的细胞免疫性疾病的理论,从遗传学角度出发,研究银屑病的遗传易感基因,是从根本上揭示该疾病病因以及发病机制的重要途径。IL－9和IL－10基因拷贝数变异与银屑病发病有明显的相关性,两者拷贝数增加可能会增加银屑病的易感性,这对于疾病的筛查和预防具有重要的临床意义。

1 Bowcock AM,Krueger JG.Getting under the skin:the immunogenetics of psoriasis.Nat Rev Immunol,2005,5(9):699－711.

2 Fanciulli M,Norsworthy PJ,Petretto E,et a1.FCGR3B copy number variation is associated with susceptibility to systemic, butnotorgan－specific,autoimmunity.Nat Genet,2007,39(6): 721－723.

3 Prans E,Kingo K,Traks T,et al.Copy number variations in IL22 gene are associated with Psoriasis vulgaris.Hum Immunol, 2013,74(6):792－795.

4Wan J,Gao Y,Zhao X,et al.The association between the copy－number variations of ZMAT4 and hematological malignancy. Hematology,2011,16(1):20－23.

5田洁,王胜军,许化溪.Th9细胞:一种新型效应性CD4＋T细胞亚群.细胞与分子免疫学杂志,2009,25(9):853－855.

6 Li H,Nourbakhsh B,Ciric B,et al.Neutralization of IL－9 amerliorates experimental autoimm une encephalomye－litis by decreasing the effector T cell population.J Immunol,2010,185 (7):4095－4100.

7Mosser DM,Zhang X.Interleukin－10:new perspectives on an old cytokine.Immunol Rev,2008,226(1):205－218.

8 Singh TP,Schön MP,Wallbrecht K,et al.Involvement of IL－9 in Th17－associated inflammation and angiogenesis of psoriasis. PLoSOne,2013,8(1):e51752.

9Asadullah K,Sabat R,Friedrich M,et a1.Interleukin－10:an important immunoregulatory cytokinewithmajor impacton psoriasis.Curr Drug Targets Inflamm Allergy,2004,3(2):185－192.

10 Asadullah K,Eskdale J,Wiese A,et a1.Interleukin－10 promoter polymorphism in psoriasis.J Invest Dermatol,2001,116 (6):975－978.

11唐莉华,钟绮丽,张杰,等.IL－9和IL－10基因拷贝数变异与白癜风发病相关性研究.中国麻风皮肤病杂志,2013,29 (4):248－250.

12Wong KK,Deleeuw RJ,Dosanjh NS,et al.A comprehensive analysis of common copy－number variations in the human genome.Am JHum Genet,2007,80(1):91－104.

(收稿:2013－07－08 修回:2013－08－12)

Relationship of IL－9 and IL－10 gene copy number variationsw ith psoriasis

HU Xiao-ping,CHEN Ban-cheng,SHAO Yong,etal.Department ofDermatology,Shenzhen Hospital,Beijing University,Shenzhen,518036

Objective:To determine the association of interleukin－9(IL－9)and interleukin－10(IL－10) gene copy number variations with psoriasis.Methods:Determination of gene copy number of IL－9 and IL－10 was achieved by RT－PCRmethod and compared between 424 psoriatic patients and 424 healthy controls.Results:The IL－9 and IL－10 gene copy numberwas higher in the psoriatic patients than in the healthy controls (P＜0.05).Conclusion:The increasing of IL－9 and IL－10 gene copy numbersmay increase the susceptibility to psoriasis.

interleukin－9；interleukin－10；gene copy number；psoriasis

广东省自然科学基金项目(编号:s2012040006694)

广东省医学科研基金项目(编号:B2012329)

深圳市科技计划项目(编号:201203035)

北京大学深圳医院皮肤科,广东深圳,518036

∗通信作者