刘明明，李炳蔚，王 冰，孟凡星，赵永刚，盛有明，李宏伟，修瑞娟

(中国医学科学院北京协和医学院微循环研究所卫生部微循环重点实验室，北京100005)

胰岛周细胞分布于胰岛毛细血管和微血管管壁，是胰岛微循环的重要组成细胞之一，具有维持胰岛β 细胞正常生理功能的作用。胰岛周细胞数量及功能异常可能是糖尿病及其并发症的病理生理基础［1］。周细胞具有组织来源特异性，应用胰岛周细胞研究其在糖尿病发病机制中的作用更为合理。本研究旨在建立大鼠原代胰岛周细胞的分离培养及鉴定方法，为研究周细胞及胰岛微循环在糖尿病发病机制中的作用提供细胞学基础。

1 材料与方法

1.1 实验动物:SPF 级8 周龄雄性Wistar 大鼠，质量200～250 g［北京维通利华实验动物技术有限公司，许可证号SCXK(京)2012-0001］。本研究经中国医学科学院微循环研究所动物伦理委员会批准。

1.2 主要实验试剂:胶原蛋白酶V、Histopaque-1077、双硫腙(dithizone，DTZ)(Sigma 公司);内皮细胞生长因子(Sciencell公司);兔抗大鼠vWF 抗体(Santa Cruz 公司);兔抗大鼠α-SMA抗体、兔抗大鼠PDGFR-β(Abcam 公司)和Alexa Fluor 488 驴抗兔IgG(Life Technologies 公司)。

1.3 实验方法

1.3.1 大鼠胰岛的分离与纯化:胆总管穿刺注入1 g/L 胶原蛋白酶V 10 mL，37 ℃15 min。振荡1 000 r/min 2 min至细沙状，10 mL Histopaque-1077 重悬，加入10 mL 培养基，2 000 r/min 20 min，吸取中间层细胞。解剖显微镜下分拣胰岛，DTZ 染色鉴定，5% CO2，37 ℃培养72 h。

1.3.2 大鼠胰岛周细胞的培养:胰岛悬浮于内皮细胞培养基，2～3 d 换液，待胰岛周细胞爬出并增殖至完全汇合后，消化传代铺EZ Slide(Millipore 公司)，5% CO2，37 ℃培养。1.3.3 大鼠胰岛周细胞的鉴定:4%多聚甲醛固定;0.3%Triton X-100 15 min;PBS 清洗，4% 牛血清白蛋白37 ℃30 min;按1∶100 分别加入抗PDGFR-β，α-SMA 或抗vWF 抗体，4 ℃过夜;PBS 清洗，按1∶1 000 加入Alexa Fluor 488 驴抗兔IgG，37 ℃避光1 h，PBS 清洗;DAPI 染核，镜检。

2 结果

2.1 大鼠胰岛分离与鉴定:大鼠原代胰岛呈圆形或椭圆形，包膜完整，大小不一(图1A);经DTZ 染色鉴定(图1B)，可见胰岛形态较为完整，细胞碎片较少，胰岛纯度较高。

图1 大鼠胰岛的分离与纯化鉴定Fig 1 Isolation and purification of rat pancreatic islets (× 150)

2.2 大鼠胰岛周细胞形态学特点及生长规律:胰岛周细胞生长缓慢，24 h 后贴壁，可伸出伪足(图2A);7 d 逐渐从胰岛中爬出(图2B)，呈不规则多边形，细胞内可见致密丝状结构，接触抑制不明显，可重叠生长(图2C，2D)。21 d 至汇合状态，消化传代后生长速度加快，7 d 进入对数期，14 d 进入平台期。

2.3 大鼠胰岛周细胞免疫荧光鉴定:胰岛周细胞α-SMA 表达阳性(图3A，B，C)，PDGFR-β 表达呈强阳性(图3D，E，F);细胞中可见部分vWF 阳性细胞，提示存在少量胰岛微血管内皮细胞混杂(图3G，H，I)。

图2 大鼠胰岛周细胞生长情况Fig 2 The growth of rat islet pericytes (×400)

图3 大鼠胰岛周细胞免疫荧光鉴定Fig 3 Identification of rat islet pericytes by immunofluorescence (×400)

3 讨论

获得稳定传代的胰岛周细胞系是探讨其在糖尿病发病机制中作用的基础。目前国内外均未见胰岛周细胞系报道，本研究大鼠原代胰岛周细胞分离培养及鉴定方法为建立胰岛周细胞系奠定了方法学基础。

目前尚无单一表面分子可独立标记周细胞。本研究应用α-SMA 和PDGFR-β 两种表面分子结合胰岛微血管管径对胰岛周细胞鉴定。胰岛微血管内皮细胞分泌的PDGF 与周细胞表面PDGFR-β 结合促进其迁移增殖，胰岛素有利于胰岛周细胞生长，因此本研究未挑除胰岛及胰岛微血管内皮细胞。

胰岛周细胞功能异常可导致胰岛微循环功能障碍［2］，损伤胰岛β 细胞。因此，建立胰岛周细胞的分离培养和鉴定技术对阐明周细胞和胰岛微循环在糖尿病发病机制中的作用、筛选糖尿病治疗新靶点具有重要意义。

［1］Beltramo E，Porta M.Pericyte loss in diabetic retinopathy:mechanisms and consequences［J］.Curr Med Chem，2013，20:3218-3225.

［2］Tang SC，Chiu YC，Hsu CT，et al.Plasticity of Schwann cells and pericytes in response to islet injury in mice［J］.Diabetologia，2013，56:2424-2434.