王玲慧等

摘 要：采集杨凌五泉、揉谷和李台3个番茄主产区表现矮化、黄化及曲叶症状的植株嫩叶，克隆番茄黄化曲叶病毒（TYLCV）基因全长并测序，依次得到病毒分离物TYLCV-SXYL2、TYLCV-SXYL3和TYLCV-SXYL4。通过多序列比对、系统发育树构建及蛋白质结构和理化性质预测等生物信息学方法进行基因组和蛋白质的特征分析，结果表明，杨凌区3个TYLCV分离物之间全长核苷酸相似度为99.3%～99.4%，是不伴随卫星分子的单组分病毒，属TYLCV-IS株系的不同分离物，全长为2 781 nt；与山东寿光病毒分离物TYLCV-SDSG亲缘关系最近，相似度为99.6%，与陕西泾阳的分离物TYLCV-SX8相似度为99.1%，与以色列株系TYLCV-IS相似度达97.7%～97.8%；编码6个蛋白质，其中CP、Rep、REn为跨膜蛋白，V2、TrAP、C4为胞内蛋白，Rep和REn为稳定蛋白，CP、V2、TrAP、C4为不稳定蛋白。

关键词：番茄黄化曲叶病毒；杨凌；番茄；生物信息学分析

中图分类号：S436.412.1+1 文献标识码：A 文章编号：1001-3547（2014）04-0054-07

番茄（Solanum lycopersicum L.）是世界上最重要的蔬菜作物之一[1]，而番茄黄化曲叶病（Tomato

yellow leaf curl disease，TYLCD）为全球番茄生产中最具威胁的“植物癌症”[2]，1961年以色列最先鉴定的番茄黄化曲叶病毒（Tomato yellow leaf curl virus，TYLCV）是其主要病原。TYLCV为单链环状DNA病毒，属于双生病毒科（Geminiviridea）菜豆金色花叶病毒属（Begomovirus），由烟粉虱（Bemisia tabaci）以持久性方式传播[3，4]，在寄主细胞核内形成的双链DNA复制中间体共编码6个开放阅读框。杨凌区是我国唯一的农业高新技术产业示范区，位于陕西省关中平原中部，2011年杨凌暴发的TYLCD已成为限制杨凌区番茄生产的主要因素，但目前未见有杨凌TYLCV全基因组分子特征及编码蛋白生物信息学分析的研究报道。本试验对杨凌区五泉、揉谷和李台的番茄主产区进行调查采样，对病毒分离物进行全长克隆、测序和变异分析，并对病毒编码蛋白质的氨基酸序列和蛋白质跨膜结构、不稳定系数等性质进行了比较分析，旨在进一步明确陕西杨凌番茄黄化曲叶病毒基因组结构和进化起源，为进一步开展番茄黄化曲叶病的防控工作、番茄分子抗病育种、病毒变异进化和病毒编码蛋白质结构功能研究提供科学依据。

1 材料与方法

1.1 试验材料与试剂

①毒源样品 在陕西省杨凌区五泉、揉谷和李台的番茄主产区采集表现生长迟滞矮化、上部叶片黄化、叶片边缘向上卷曲、褶皱簇状、后期不能正常开花结果症状的番茄植株嫩叶各1份，常温下用采样袋密封带回，液氮速冻后置于-80℃保存。

②试剂 Pfu DNA Polymerase购自Fermenents公司，琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒（离心柱型）购自Bioteke公司，质粒微量提取试剂盒购自BIOMIGA公司，PrimeSTAR Max DNA Polymerase、加A尾试剂盒A-Tailing Kit、克隆载体PMD18-T和DH5α感受态大肠杆菌购自TaKaRa公司，试验所用引物由生工生物工程（上海）股份有限公司合成，序列测定由南京金斯瑞生物科技有限公司完成。

1.2 试验方法

①植物总DNA的提取和病毒分子鉴定 DNA的提取用CTAB法，得到的样品DNA溶液于-20℃保存备用。TYLCV鉴定用李常保等[5]设计的TYLCV特异引物TYLCV-F/TYLCV-R；阳性对照TYLCV-SH2由浙江大学周雪平教授馈赠。DNA-B组分鉴定用双生病毒DNA-B组分鉴定通用引物PCRc1/PBLv2040[6]；卫星DNA β鉴定用双生病毒卫星DNA β鉴定通用引物Beta01/Beta02[7]，引物序列和目标条带大小见表1。

②分子克隆和测序 用TYLCV特异引物TYLCV-F/TYLCV-R，Pfu DNA Polymerase扩增部分片段（约500 bp）后回收，用A-tailing Kit加A尾后克隆至PMD18-T载体，转化入DH5α感受态大肠杆菌，经氨苄抗性筛选、菌液PCR鉴定及提取质粒酶切验证后用于测序。依据测得的519 bp序列用Primer Premier软件（Version 5.0，Premier，Canada）设计相邻背向引物SX-F/SX-R，用PrimeSTAR Max DNA Polymerase扩增病毒基因组全长，经克隆并测序得到基因组全序列。

③序列比对分析和进化树的构建 通过NCBI Blast（Basic local alignment search tool）寻找TYLCV同源序列信息。用DNAStar Package的MEGA （Version 5.05，Madison，Wis，USA）软件[8]中的

MUSCLE算法进行多序列比对分析后，用邻近相连法（Neighbor-joining）构建基于病毒DNA-A核苷酸全序列的系统进化树。用DNAMAN（Version 5.2.2，Lynnon Biosoft，Quebec Canada）软件构建不同TYLCV分离物的同源矩阵。

④病毒基因组结构分析 病毒开放阅读框的查找利用NCBI的ORF Finder （Open Reading Frame Finder，http：//www.ncbi.nlm.nih.gov/gorf/gorf.html）在线工具。病毒基因组结构图利用DNAStar Package中的SeqBuilder软件绘制。

⑤蛋白质跨膜结构和理化性质的预测及分析 病毒蛋白质的跨膜结构利用TMpred （http：//www.ch.embnet.org/software/TMPRED_form.html）在线工具预测。蛋白质理化性质利用ExPASy的ProtParam（http：//web.expasy.org/protparam/）在线工具进行分析。

2 结果与分析

2.1 采集样品DNA病毒全长克隆和聚类分析

①TYLCV病毒分子鉴定 通过用TYLCV特异引物TYLCV-F/TYLCV-R对样品DNA进行PCR鉴定，结果显示，3个样品TYLCV-SXYL2、SXYL3和SXYL4都为带毒植株（图1），并克隆测序得到519 bp序列。以双生病毒DNA-B组分通用引物PCRc1/PBLv2040进行PCR扩增，未得到预期500～650 bp大小的条带，以双生病毒卫星DNA β鉴定通用引物Beta01/Beta02进行PCR反应，也未得到预期1 200～1 400 bp大小的条带。结果表明，陕西杨凌地区侵染番茄的TYLCV为不含DNA-B且不伴随卫星DNA β的单组分病毒，只含DNA-A。

②DNA-A全长的同源矩阵 选择NCBI登录的国内外不同地区分离的19个TYLCV分离物（表2），用DNAMAN多序列比对后构建同源矩阵（表3）。发现杨凌区3个分离物TYLCV-SXYL2、SXYL3、SXYL4核苷酸序列全长之间相似度为99.3%～99.4%，且和TYLCV-IS相似度为97.7%～97.8%。杨凌区的3个病毒分离物与山东寿光分离物TYLCV-SDSG的相似度都为99.6%，与陕西泾阳的分离物TYLCV-SX8的相似度都为99.1%。

③基于DNA-A全长的系统进化树 陕西杨凌3个TYLCV分离物同19个不同国家地区的TYLCV通过MEGA5.05软件中MUSCLE算法多序列比对后，用邻近相连（Neighbor-Joining）法构建系统进化树（图2）发现，杨凌分离物和山东寿光分离物TYLCV-SDSG、河北石家庄分离物TYLCV-SJZ1、陕西泾阳分离物TYLCV-SX8、安徽分离物TYLCV-AH1、北京分离物TYLCV-Beijing3、美国分离物TYLCV-USA及浙江分离物TYLCV-ZJ8在同一小支上，且与山东寿光分离物TYLCV-SDSG亲缘关系最近。上述分离物还与上海分离物TYLCV-SH2[9]、日本分离物TYLCV-Janpan、荷兰分离物TYLCV-Netherlands和以色列株系TYLCV-IS在同一大支上。意大利撒丁岛分离物TYLCSV和西班牙马加拉分离物TYLCMalV在同一支。广东分离物TYLCGV-G3和越南分离物TYLCVNV在同一支。新疆分离物TYLCV-XJ26-4和广西分离物中国番茄黄化曲叶病毒TYLCCNV为同一支。云南分离物TYLTHV-Y72和泰国分离物TYLCTHV在同一支。由此可知，我国番茄黄化曲叶病毒的分布和种类同样有较大的复杂性和多样性，而杨凌番茄黄化曲叶病毒分离物很可能由最早发现的TYLCV-IS发展而来，且与山东寿光分离物亲缘关系最近，基于杨凌地区与山东寿光种苗交易频繁的现状，推测很可能是因为感病幼苗交易带来了病毒传播与蔓延。

2.2 病毒DNA-A全长序列和基因组结构

设计背向引物PCR扩增并克隆得到病毒DNA-A全长。测序结果表明，TYLCV-SXYL2、SXYL3、SXYL4（GenBank登录号依次为KC138545、KC138544、KC138543）全长都为2 781 nt，共编码6个开放阅读框（图3），在病毒链上编码外壳蛋白和AV2蛋白，在互补链上编码复制相关蛋白、转录激活子、复制增强子和AC4蛋白。在AC1和AV2之间有313 nt的非编码区，也叫基因间隔区。

①基因间隔区 基因间隔区（Intergenic Region，IR）位于1～147 nt和2 616～2 781 nt，共含313个核苷酸，有调控病毒复制和转录起始必须的元件，含有病毒复制和转录所必需的结构域以及茎环结构，茎环顶端有保守的九核苷酸TAATATT/AC序列。由于IR区相对于编码区选择压小，也是病毒变异最活跃的区域。通过对TYLCV-SXYL2、SXYL3、SXYL4 和 TYLCV-IS的IR区核苷酸序列比较（图4）发现，其特征序列中茎环顶端的九核苷酸TAATATT/AC（位于2 775～2 781 nt及1～2 nt）保守序列、TATA box和TATATA box，与TYLCV-IS一致，但CAAT box和5～8 nt短重复序列已表现出与TYLCV-IS有较大差异，其中短重复序列是Rep蛋白的结合位点。

②编码蛋白的结构和性质分析 为进一步了解杨凌番茄黄化曲叶病毒分离物编码蛋白质氨基酸序列的变异特点和更好地进行蛋白质性质分析，将TYLCV-SXYL4与19个其他地区分离物及TYLCV-SXYL2、SXYL3编码的6个蛋白质氨基酸序列相似度进行比较分析（表5），结果显示，杨凌3个分离物和越南番茄黄化曲叶病毒TYLCVNV、以色列TYLCV-IS转录激活子TrAP的氨基酸序列完全相同。TYLCV- SXYL3、 SXYL4和山东寿光分离物TYLCV-SDSG及河北石家庄分离物TYLCV-SJZ1复制增强子REn的氨基酸序列完全相同，且与TYLCV-IS的REn氨基酸序列相比，第58位由缬氨酸（Valine， V）突变为丙氨酸（Alanine，A）、第59位由甲硫氨酸（Methionine，M）突变为亮氨酸（Leucine，L）、第94位由天冬氨酸（Aspartic acid，D）突变为酪氨酸（Tyrosine，Y）、第124位由谷氨酸（Glutamic acid，E）突变为丙氨酸。TYLCV-SXYL2、SXYL3、SXYL4和日本分离物TYLCV-Japan、山东寿光分离物TYLCV-SDSG、上海分离物TYLCV-SH2、河北石家庄分离物TYLCV-SJZ1的C4蛋白氨基酸序列完全相同，与TYLCV-IS的C4蛋白氨基酸序列相比，第64位由脯氨酸（Proline，P）突变为丝氨酸（Ser，S）、第67位由甲硫氨酸突变为异亮氨酸（Isoleucine，I）、第84位由赖氨酸（Lysine，K）突变为精氨酸（Arginine，R）。

通过TMpred在线工具分别对杨凌3个病毒分离物编码的6个蛋白进行跨膜结构预测发现，CP、 Rep、REn存在跨膜结构（图5），而V2、TrAP、C4为胞内蛋白；杨凌3个病毒分离物的CP、V2、Rep和REn氨基酸序列有1～2个位点的区别，没有影响蛋白质的跨膜结构的预测结果。

利用ExPasy的ProtParam在线工具对TYLCV-SXYL2、SXYL3、SXYL4和TYLCV-IS编码蛋白的理论等电点、不稳定系数和亲水性平均系数进行预测和比较分析（表6），发现杨凌番茄黄化曲叶病毒分离物和TYLCV-IS编码AV2蛋白和REn的理论等电点差异较大。按不稳定系数<40为稳定蛋白、不稳定系数>40为不稳定蛋白推测，CP、V2、TrAP、C4为不稳定蛋白，Rep和REn为稳定蛋白。

3 讨论与结论

为了进一步明确引起杨凌地区不同番茄主产区番茄黄化曲叶病害的病原种类和分子特征，依据Begomovirus分类中同时满足外壳蛋白氨基酸序列相似度>90%和核苷酸全长相似性>89%才可能为同一病毒的不同分离物的标准[10]，本研究在杨凌区3个不同番茄主产区调查采样并对全基因组进行了测序和基因组结构分析。本研究表明，在杨凌区五泉、揉谷和李台的番茄主产区引起番茄黄化曲叶病的病原确为TYLCV-IS株系的不同分离物（TYLCV-SXYL2、TYLCV-SXYL3、TYLCV-SXYL4），经鉴定，这3个分离物都为单组分双生病毒且不伴随卫星分子。李云洲等[11]克隆了杨凌地区西北农林科技大学园艺实验场番茄黄化曲叶病毒外壳蛋白基因后发现，其氨基酸序列与以色列株系TYLCV-IS相似度>90%。

陕西省泾阳县2010年暴发番茄黄化曲叶病

后[12]，杨凌地区各大番茄主产区在2011年相继发现番茄黄化曲叶病。但由系统进化树构建及病毒编码的6个蛋白氨基酸相似度比对结果发现，杨凌与山东寿光分离物TYLCV-SXSG亲缘关系比与地理位置最近的泾阳分离物TYLCV-SX8的近，病毒蛋白特别是TYLCV-SXYL3、SXYL4编码的REn的氨基酸序列相似度与TYLCV-SDSG达100%，与泾阳TYLCV-SX8仅为97.8%，这说明了植物病毒的传播流行不仅受地理位置、气候环境的影响，人为因素也起着越来越重要的作用。

虽然TYLCV基因组小，编码的蛋白数量有限，但其与寄主的互作及致病机理仍然不清楚[13]。本研究对不同TYLCV编码的蛋白质间的氨基酸相似度、蛋白质的理化特性和跨膜结构进行了生物信息学分析及比较，表明CP、Rep、REn为跨膜蛋白，V2、 TrAP、C4为胞内蛋白，Rep和REn为稳定蛋白，CP、 V2、TrAP、C4为不稳定蛋白。

参考文献

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[11] Diaz‐Pendon J A， Truniger V， Nieto C， et al. Advances in understanding recessive resistance to plant viruses[J]. Molecular Plant Pathology， 2004， 5（3）： 223-233.

[12] 阮涛，杨会房，杨水英，等.分离自陕西泾阳番茄的番茄黄化曲叶病毒 （TYLCD）的分子特征[J].农业生物技术学报，2013，21（1）：97-105.

[13] Verlaan M G， Hutton S F， Ibrahem R M， et al. The tomato yellow leaf curl yirus resistance genes Ty-1 and Ty-3 are allelic and code for DFDGD-Class RNA-dependent RNA polymerases[J]. PLoS Genetics， 2013， 9（3）： e1003399.

通过TMpred在线工具分别对杨凌3个病毒分离物编码的6个蛋白进行跨膜结构预测发现，CP、 Rep、REn存在跨膜结构（图5），而V2、TrAP、C4为胞内蛋白；杨凌3个病毒分离物的CP、V2、Rep和REn氨基酸序列有1～2个位点的区别，没有影响蛋白质的跨膜结构的预测结果。

利用ExPasy的ProtParam在线工具对TYLCV-SXYL2、SXYL3、SXYL4和TYLCV-IS编码蛋白的理论等电点、不稳定系数和亲水性平均系数进行预测和比较分析（表6），发现杨凌番茄黄化曲叶病毒分离物和TYLCV-IS编码AV2蛋白和REn的理论等电点差异较大。按不稳定系数<40为稳定蛋白、不稳定系数>40为不稳定蛋白推测，CP、V2、TrAP、C4为不稳定蛋白，Rep和REn为稳定蛋白。

3 讨论与结论

为了进一步明确引起杨凌地区不同番茄主产区番茄黄化曲叶病害的病原种类和分子特征，依据Begomovirus分类中同时满足外壳蛋白氨基酸序列相似度>90%和核苷酸全长相似性>89%才可能为同一病毒的不同分离物的标准[10]，本研究在杨凌区3个不同番茄主产区调查采样并对全基因组进行了测序和基因组结构分析。本研究表明，在杨凌区五泉、揉谷和李台的番茄主产区引起番茄黄化曲叶病的病原确为TYLCV-IS株系的不同分离物（TYLCV-SXYL2、TYLCV-SXYL3、TYLCV-SXYL4），经鉴定，这3个分离物都为单组分双生病毒且不伴随卫星分子。李云洲等[11]克隆了杨凌地区西北农林科技大学园艺实验场番茄黄化曲叶病毒外壳蛋白基因后发现，其氨基酸序列与以色列株系TYLCV-IS相似度>90%。

陕西省泾阳县2010年暴发番茄黄化曲叶病

后[12]，杨凌地区各大番茄主产区在2011年相继发现番茄黄化曲叶病。但由系统进化树构建及病毒编码的6个蛋白氨基酸相似度比对结果发现，杨凌与山东寿光分离物TYLCV-SXSG亲缘关系比与地理位置最近的泾阳分离物TYLCV-SX8的近，病毒蛋白特别是TYLCV-SXYL3、SXYL4编码的REn的氨基酸序列相似度与TYLCV-SDSG达100%，与泾阳TYLCV-SX8仅为97.8%，这说明了植物病毒的传播流行不仅受地理位置、气候环境的影响，人为因素也起着越来越重要的作用。

虽然TYLCV基因组小，编码的蛋白数量有限，但其与寄主的互作及致病机理仍然不清楚[13]。本研究对不同TYLCV编码的蛋白质间的氨基酸相似度、蛋白质的理化特性和跨膜结构进行了生物信息学分析及比较，表明CP、Rep、REn为跨膜蛋白，V2、 TrAP、C4为胞内蛋白，Rep和REn为稳定蛋白，CP、 V2、TrAP、C4为不稳定蛋白。

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[12] 阮涛，杨会房，杨水英，等.分离自陕西泾阳番茄的番茄黄化曲叶病毒 （TYLCD）的分子特征[J].农业生物技术学报，2013，21（1）：97-105.

[13] Verlaan M G， Hutton S F， Ibrahem R M， et al. The tomato yellow leaf curl yirus resistance genes Ty-1 and Ty-3 are allelic and code for DFDGD-Class RNA-dependent RNA polymerases[J]. PLoS Genetics， 2013， 9（3）： e1003399.

通过TMpred在线工具分别对杨凌3个病毒分离物编码的6个蛋白进行跨膜结构预测发现，CP、 Rep、REn存在跨膜结构（图5），而V2、TrAP、C4为胞内蛋白；杨凌3个病毒分离物的CP、V2、Rep和REn氨基酸序列有1～2个位点的区别，没有影响蛋白质的跨膜结构的预测结果。

利用ExPasy的ProtParam在线工具对TYLCV-SXYL2、SXYL3、SXYL4和TYLCV-IS编码蛋白的理论等电点、不稳定系数和亲水性平均系数进行预测和比较分析（表6），发现杨凌番茄黄化曲叶病毒分离物和TYLCV-IS编码AV2蛋白和REn的理论等电点差异较大。按不稳定系数<40为稳定蛋白、不稳定系数>40为不稳定蛋白推测，CP、V2、TrAP、C4为不稳定蛋白，Rep和REn为稳定蛋白。

3 讨论与结论

为了进一步明确引起杨凌地区不同番茄主产区番茄黄化曲叶病害的病原种类和分子特征，依据Begomovirus分类中同时满足外壳蛋白氨基酸序列相似度>90%和核苷酸全长相似性>89%才可能为同一病毒的不同分离物的标准[10]，本研究在杨凌区3个不同番茄主产区调查采样并对全基因组进行了测序和基因组结构分析。本研究表明，在杨凌区五泉、揉谷和李台的番茄主产区引起番茄黄化曲叶病的病原确为TYLCV-IS株系的不同分离物（TYLCV-SXYL2、TYLCV-SXYL3、TYLCV-SXYL4），经鉴定，这3个分离物都为单组分双生病毒且不伴随卫星分子。李云洲等[11]克隆了杨凌地区西北农林科技大学园艺实验场番茄黄化曲叶病毒外壳蛋白基因后发现，其氨基酸序列与以色列株系TYLCV-IS相似度>90%。

陕西省泾阳县2010年暴发番茄黄化曲叶病

后[12]，杨凌地区各大番茄主产区在2011年相继发现番茄黄化曲叶病。但由系统进化树构建及病毒编码的6个蛋白氨基酸相似度比对结果发现，杨凌与山东寿光分离物TYLCV-SXSG亲缘关系比与地理位置最近的泾阳分离物TYLCV-SX8的近，病毒蛋白特别是TYLCV-SXYL3、SXYL4编码的REn的氨基酸序列相似度与TYLCV-SDSG达100%，与泾阳TYLCV-SX8仅为97.8%，这说明了植物病毒的传播流行不仅受地理位置、气候环境的影响，人为因素也起着越来越重要的作用。

虽然TYLCV基因组小，编码的蛋白数量有限，但其与寄主的互作及致病机理仍然不清楚[13]。本研究对不同TYLCV编码的蛋白质间的氨基酸相似度、蛋白质的理化特性和跨膜结构进行了生物信息学分析及比较，表明CP、Rep、REn为跨膜蛋白，V2、 TrAP、C4为胞内蛋白，Rep和REn为稳定蛋白，CP、 V2、TrAP、C4为不稳定蛋白。

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