郑翠玲，向 华，黄 元，陈 晶，王晓虎，宣 华

（1.广东省农业科学院动物卫生研究所，广东 广州510640；2.唐山职业技术学院，河北 唐山064003）

猫杯状病毒（Feline Calicivirus，FCV）是猫科动物的一种高度传染性病原，能引起猫的口腔或上呼吸道感染，有的毒株还能导致跛行。高玉伟[1]等从我国野生动物中分离到猫杯状病毒（FCV），这表明猫杯状病毒对野生珍稀动物的健康造成了极大的威胁。

FCV属于杯状病毒科（Caliciviridae）杯状病毒属（Calicivirus）。尽管此类病毒早已发现，但由于缺乏相应的细胞培养系统，导致对其分子生物学特性的研究进展缓慢。猫杯状病毒是杯状病毒科中惟一可在体外成功培养的病毒[2]。随着反向遗传学技术的发展，许多正链RNA病毒的研究取得重大进展[3]。本研究旨在建立FCV感染性克隆，构建嵌合载体，进而研究其他杯状病毒生物学特性和致病机理。

1 材料与方法

1.1 病毒、细胞、质粒及菌种 FCV病毒液和质粒PFCV＋T由广东省农业科学院兽医研究所保存；La Taq DNA聚合酶、反转录酶AMVRT、限制性内切酶Sma I、Sph I Mlu I、DNA凝胶回收试剂盒均为大连TaKaRa公司产品；LipofectamineTM2 000 Reagent、LSTRIZol试剂为Invitrogen公司产品；高纯度质粒提取纯化试剂盒为TIANGEN公司产品；细胞培养用MEM、新生小牛血清均为GIBOCOBRL公司产品。

1.2 引物设计 参照已经获得的FCV CH-GD株全基因组序列[4]，设计了扩增FCV全基因的2对引物，在其中1对引物中引入Sma I，Sph I酶切位点和T7启动子核心序列，在另1对引物中引入一个突变位点，形成一个新的酶切位点Mlu I，两对引物序列如下：

P1：5′-CAGCCCGGGTAATACGACTCACTATAG TAAAAGAAATTTGAGACAATG-3′；P2：5′-GGAACGCGTGTCTATATGCAAGC-3；P3：5-GGAACGCGTGTCTATATGCAAGC-3′；P4：5′CTGCATGCTTTTTTT TTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTCCCTGGGGTTAGGCGC-3′。引物由上海Invitrogen生物技术有限公司合成。

1.3 聚合酶链式反应（PCR） 用已经获得的质粒PFCV＋T为模板进行PCR扩增。……