矫春丽，刘学杰

（烟台市食品药品检验所，山东烟台264000）

南极假丝酵母脂肪酶B在制备手性药物中的应用

矫春丽，刘学杰

（烟台市食品药品检验所，山东烟台264000）

结合近期国内外的文献，本文详细介绍了南极假丝酵母脂肪酶B（CALB）在手性醇、胺、酸选择性的拆分以及转酯等的应用。利用脂肪酶合成手性药物是药物合成研究的一个重要领域，CALB在一些药物的拆分和合成中表现出了良好的选择性，本文主要综述了其在手性醇、胺、酸选择性拆分以及转酯中的应用，希望能够为手性药物的合成提供方向。

南极假丝酵母脂肪酶；南极假丝酵母脂肪酶B；手性药物；合成

生物催化剂能够在温和的条件下催化化学反应并同时展现出极高的选择性，由于这种独特的性质，生物催化逐渐成为精细化工、医药、农药化学品及其中间体合成的核心技术［1］，特别是在小分子手性药物的制备过程中，生物催化不仅能够达到各种法规所规定的合成手性药物所需的光学纯度，还能够减少对环境的影响、替代复杂的化学合成路线等，是发展绿色、环境友好、高效节能的制药工业的有力工具［2］。近年来，不断有利用生物催化制备小分子手性药物中间体特别是“重磅药物”的例子出现，如阿托伐他汀［3］、西格列汀［4］等。

脂肪酶（甘油三酯水解酶，EC 3.1.1.3）是广泛存在于有机体内能够催化甘油三酯水解的一类酶。目前，脂肪酶是在有机合成中研究和应用最多的生物催化剂，因为脂肪酶具有底物范围广、催化效率、选择性高，耐受有机溶剂［5］、可适度耐高温、无毒、对环境友好并且低成本等优点。来源于南极假丝酵母（Candida antarctica）的脂肪酶A（Candida antarctica lipase A，CALA）和脂肪酶B（Candida antarctica lipase B，CALB）便是研究和应用较多的两种脂肪酶［6］，本文将着重讨论CALB在制备手性药物中的应用。

1 南极假丝酵母脂肪酶

1.1 CALA、CALB简介 CALA和CALB都具有独特的催化性质，CALA是热稳定性的酶，其最适温度可达90℃，尽管CALB的热稳定性不及CALA，但固定化的CALB和CALA均可在适度高温的环境中维持活性的长时间稳定。虽然来源于同一菌种，但CALA和CALB的一些催化性质却有所差别［6］：相对于CALA，CALB具有Sn－3选择性；类似于大多数脂肪酶，CALA具有界面接触效应，CALB则是少数没有这种效应的脂肪酶之一，因而CALB能够在单相溶媒介质中具有高的催化活性；CALB是拆分醇和胺的最优催化剂之一，CALB在制备光学纯的羟基和氨基化合物中得到了广泛的应用，高的对映选择性和简单的操作流程是CALB广泛应用于拆分仲醇和伯胺的基础；尽管CALA在有机合成中应用远少于CALB，但却被证明在酰化叔醇和仲胺时比CALB具有更高的活性，这使得CALA在拆分具立体位阻的化合物中具有极大的应用前景［7］。

1.2 动力学拆分 CALA和CALB可催化水解、酯化、转酯、氨解等反应，这些反应可用来拆分外消旋的醇、氨和酸等从而制备光学纯的化合物。以仲醇为例，外消旋的仲醇分为R型和S型，脂肪酶在选择性的将R型的仲醇酰化的同时却不催化S型的反应，从而将消旋的仲醇拆分，该过程称为动力学拆分（kinetic resolution，缩写为KR）［8］。

CALB和CALA对消旋的仲醇、伯胺的高选择性是由脂肪酶立体结构及底物的结构共同决定的。这种选择性可用Kazlauskas经验法则［9］来解释，以CALB为例，其模型化合物手性仲醇中手性碳两侧取代基分别为中等大小的基团（ML，不大于丙基）和较大的基团（LL，大于丙基），其中R构型的化合物能与CALB的活性中心充分结合而很快反应，S型化合物则由于无法进入CALB活性中心而反应很慢或基本不能反应如图1。

图1 CALB对消旋仲醇的选择性示意图

由于反应速率上的巨大差异，CALB对符合上述模型的对映体表现出极高的选择性（＞99%），这种高选择性使CALB在动力学拆分外消旋醇、氨、羧酸等化合物中广泛应用［6］，特别在制备小分子手性药物及其关键中间体中。此外，CALB还可通过转酯、氨解等反应应用于药物合成中。下文将据反应类型，综述CALB在制备手性药物中的应用。

2 南极假丝酵母脂肪酶B在制备手性药物中的应用

2.1 （动态）动力学拆分醇

2.1.1 伯醇 帕罗西汀（Paroxetine）为强效、高选择性5－羟色胺再摄取抑制剂，主要用于治疗各种抑郁症，其关键中间体（－）－paroxol可通过重结晶、不对称合成、生物催化拆分的方法进行制备，利用脂肪酶介导的动力学拆分便是其中之一。CALB可对映选择性酰化（±）－trans－1从而拆分得到用于合成帕罗西汀的中间体（3S，4R）－1［10］，通过优化反应条件，当采用苯甲酸乙烯酯作为酰基供体、甲苯作为溶剂时，反应具有较高的转化率（51%）和对映选择性（E＞100）见图2。与化合合成相比，该反应简单且易于放大，适宜于进行规模化应用。

图2 CALB通过动力学拆分反应制备帕罗西汀中间体

依地普仑（Escitalopram）也是一种抗抑郁药，是S构型西酞普兰的，尽管西酞普兰以外消旋混合物形式用于抑郁症的治疗，但研究表明R－构型西酞普兰与S构型（依地普仑）相比基本无活性，因此制备单一对映体（依地普仑）就极其重要。rac－3为合成依地普仑的重要中间体，可利用CALB进行拆分［11］。由于化合物3其手性叔醇位置空间位阻较大，CALB不能将其酰化，但CALB可将远离手性中心的伯醇酰化，从而将rac－3拆分，未参与反应的化合物（s）－3可用于合成依地普仑。尽管反应未发生在手型中心位置，但该反应仍具有较高的产率（53%）和选择性，化合物ee值可达99%（见图3）。

图3 CALB通过动力学拆分反应制备依地普仑中间体

2.1.2 仲醇 利斯的明（Rivastigmine）是胆碱酯酶抑制剂，商品名为艾斯能，可用于治疗老年痴呆。Miotine也是胆碱酯酶抑制剂主要用作缩瞳药。化合物（R）－6可用于合成这两种手性药物，利用CALB结合金属Ru催化剂，可将消旋的化合物rac－5进性动态动力学拆分，该典型的DKR反应具有较高的产率和选择性，得到酯产率可达95%，ee值大于99%［12］，该化合物可较容易的通过CALB催化的水解反应将乙酰基脱掉，从而用于进一步合成。类似的，通过动态动力学拆分化合物rac－7也可得到合成利斯的明的中间体［13］（见图4）。

度洛西汀（Duloxetine）是一种5－羟色胺和去甲肾上腺素再摄取双重抑制剂，用于治疗各种抑郁症。逆合成分析表明，化合物（3）－9可用于合成度洛西汀。该化合物可利用CALB动力学拆分得到［14］，尽管化合物rac－9并不完全符合Kazlauskas模型，且含有吸电子的卤族元素，但CALB依旧对该化合物具有较高的选择性（见图5）。

图4 CALB通过动态动力学拆分反应制备利斯的明中间体

图5 CALB通过动力学拆分反应制备洛西汀中间体

2.2 （动态）动力学拆分胺 CALB在动力学拆分上述仲醇中展现出了良好的活性及选择性，与仲醇类似，符合Kazlauskas经验法则的伯胺同样可作为CALB的底物。如图所示，化合物rac－11可用CALB进行动力学拆分，得到的R构型酰胺和未反应的S构型伯胺都有较高的ee值［12］。在动力学拆分反应中，剩余的S构型可用于合成利斯的明和Miotine（见图6）。

图6 CALB通过动力学拆分反应制备利斯的明中间体

具有药理学活性的苯丙胺及其一系列衍生物同样可以利用CALB进行动力学拆分，得到光学纯化合物可用于合成一系列的手性药物，例如对位、邻位、间位甲氧基取代的苯丙胺可用于合成安非他命类药物（Amphetamine）［15］和阿福特罗（Arformoterol，（R，R）－福莫特罗）［16］，间位三氟甲基取代的苯丙胺可用于合成芬氟拉明（Fenfluramine）［17］等（见图7）。与拆分醇不同，动力学拆分胺时，作为溶剂的乙酸乙酯可同时作为酰基供体。

2.3 其他（酸、转酯、氨解等） 类似于仲醇及伯胺，消旋的羧酸及衍生物也可通过CALB进行动力学拆分。布洛芬（Ibuprofen）主要用于解热镇痛及抗炎，尽管目前大部分布洛芬制剂以外消旋混合物使用，但实验表明其S构型活性是R构型活性的160倍。利用CALB催化的转酯反应，可将布洛芬乙烯酯进行动力学拆分［18］，得到的S布洛芬酯ee值可达99%（见图8）。

阿夫唑嗪（Alfuzosin）为新型的α1受体阻滞剂，可用于治疗高血压，也可用于治疗前列腺增生。报道的以化合物17为起始原料的化学合成路线包含一些有毒的试剂且需采用苛刻的反应条件，而利用脂肪酶CALB通过酯化、氨解可一步合成化合物19［19］，不仅无毒条件温和，且具有较高的产率。得到的化合物19可用于合成阿夫唑嗪（见图9）。

吗替麦考酚酯（Mycophenolate mofetil）一种新型的免疫抑制剂，主要用于预防和治疗器官移植后的排斥反应。目前主要采用将麦考酚酸与N－羟乙基吗啉在高温下酯化来合成吗替麦考酚酯，该反应的缺点是容易生成麦考酚酸的缩聚物。最近报道了一种利用脂肪酶催化合成吗替麦考酚酯的新方法［20］，首先利用CALB催化麦考酚酸与低分子量脂肪族醇（如乙醇）酯化得到化合物21，再利用CALB介导21与N－羟乙基吗啉转酯从而合成吗替麦考酚酯。与化学合成相 比，该反应副产物少且产率高（见图10）。

图7 CALB通过动力学拆分反应制备安非他命类药物中间体

图8 CALB通过转酯反应制备布洛芬中间体

图9 CALB通过酯化、氨解反应制备阿夫唑嗪中间体

图10 CALB通过酯化、转酯反应制备吗替麦考酚酯中间体

3 结论与展望

天然来源的抗生素等药物多为具有纯光学活性的手性药，但是经由化学合成得到的药物往往是对映异构，因此，手性药物的分离，甚至在化学合成中定向的进行制备，消除对应异构体的影响成了合成制备手性药物的关键。CALB能够在较温和的条件下具有较高的选择性，由于生物催化剂的这种特性，使得生物催化剂正在或者已经在手性药物的合成中得到应用，因此，CALB的研究对于手性药物的制备具有重要的意义。

［1］Pollard DJ，Woodley JM.Biocatalysis for pharmaceutical intermediates：the future is now［J］.Trends Biotechnol，2007，25（2）：66－73.

［2］Tao J，Xu JH.Biocatalysis in development of green pharmaceutical processes［J］.Curr Opin Chem Biol，2009，13（1）：43－50.

［3］Steven K.Ma，John Gruber，Chris Davis，et al.A greenby－design biocatalytic process for atorvastatin intermediate［J］.Green Chem，2010，12：81－86.

［4］Savile CK，Janey JM，Mundorff EC，et al.Biocatalytic asymmetric synthesis of chiral amines from ketones applied to sitagliptin manufacture［J］.Science，2010，329（5989）：305－309.

［5］Klibanov AM.Improving enzymes by using them in organic solvents［J］.Nature，2001，409（6817）：241－246.

［6］Ole Kirk，Morten Würtz Christensen.Lipases from Candida antarctica：Unique biocatalysts from a unique origin［J］，Organic process research＆development，2002，6（4）：446－451.

［7］Vicente Gotor－Fernández，Eduardo Busto，Vicente Gotor.Candida antarctica Lipase B：An Ideal Biocatalyst for the Preparation of Nitrogenated Organic Compounds［J］.Advanced Synthesis＆Catalysis，2006，348（7－8）：797－812.

［8］Ghanem A，Aboul－Enein，HY.Lipase－mediated chiral resolution of racemates in organic solvents［J］.Tetrahedron：Asymmetry，2004，15（21）：3331－3351.

［9］Kazlauskas RJ，Weissfloch ANE，Rappaport AT，et al.A rule to predict which enantiomer of a secondary alcohol reacts faster in reactions catalyzed by cholesterol esterase，lipase from Pseudomonas cepacia，and lipase from Candida rugosa［J］.J Org Chem，1991，56（8）：2656－2665.

［10］de Gonzalo G，Brieva R，Sanchez VM，etal.Enzymatic esolution of trans－4－（4′－luorophenyl）－3－hydroxymethylpiperidines，key intermediates in the synthesis of（－）－Paroxetine［J］.J Org Chem，2001，66（26）：8947－8953.

［11］Solares LF，Brieva R，Quirós M，et al.Enzymatic resolution of a quaternary stereogenic centre as the key step in the synthesis of（S）－citalopram［J］.Tetrahedron：Asymmetry，2004，15（2）：341－345.

［12］Mangas－Sanchez J，Rodriguez－Mata M，Busto E，et al.Chemoenzymatic synthesis of rivastigmine based on lipase－catalyzed processes［J］.JOrg Chem，2009，74（15）：5304－5310.

［13］Han K，Kim C，Park J，et al.Chemoenzymatic synthesis of rivastigmine via dynamic kinetic resolution as a key step［J］.JOrg Chem，2010，75（9）：3105－3108.

［14］Kamal A，Khanna，Ramu R，et al.Chemoenzymatic synthesis of duloxetine and its enantiomer：lipase－catalyzed resolution of 3－hydroxy－3－（2－thienyl）propanenitrile［J］.Tetrahedron Letters，2003，44（25）：4783－4787.

［15］Gonzalez－Sabin J，Gotor V，Rebolledo F.CAL－B－catalyzed resolution of some pharmacologically interestingβ -substituted isopropylamines［J］.Tetrahedron：Asymmetry，2002，13（12）：1315－1320.

［16］Campos F，Guerrero A，Bosch MP.An efficientenantio selective synthesis of（R，R）－formoterol，a potent bronchodilator，using lipases［J］.Tetrahedron：Asymmetry，2000，11（13）：2705－2717.

［17］Garcia－Urdiales E，Rebolledo F，Gotor V.Enzymatic one－pot resolution of two nucleophiles：alcohol and amine［J］.Tetrahedron：Asymmetry，2000，11（7）：1459－1463.

［18］Henke E，Schuster S，Yang H，et al，Lipase－Catalyzed Resolution of Ibuprofen［J］.Monatshefte für Chemie，2000，131（6）：633－638.

［19］Alicia Baldessari，Constanza P，Mangone.One－pot biocatalyzed preparation of substituted amides as intermediates of pharmaceuticals［J］.JMol Catal B Enzym，2001，11（4－6）：335－341.

［20］Paride G，Paolo P.Method for the preparation ofmycophenolate mofetil by enzyme tranesterification：US，7727751［P］.2005－07－25.

The application for cardida antarctica lipase B in chiral drugs preparation

JIAO Chun-li，LIU Xue-jie
（Yantai Institute for Food and Drug Contorl，Yantai264000，China）

Brief introduction for CALB in chiral drugs preparation.According to recent domestic and foreign literature，details of the application for CALB in chiral alcohols，amines，acid selective separation transesterification and so on were introduced.The application for lipase in chiral drugs preparation is an important area for drug synthesis，the authormainly reviewed the application for CALB in chiral alcohols，amines，acid selective separation，transesterification，expecting to provide reference for chiral drugs preparation.

Cardida antarctica lipase；CALB；Chiral drug；Synthesis

R918

：A

2095－5375（2014）07－0406－005

矫春丽，女，研究方向：药物分析，E－mail：baoran03_17＠sina.cn