王恒叶聿程谢必峰

（1.福建师范大学生命科学学院，福建 福州 350018；2.国家茶叶质量监督检验中心，福建 安溪 362400）

微生物法控制马尾松树脂障碍

王恒1叶聿程2谢必峰1

（1.福建师范大学生命科学学院，福建 福州 350018；2.国家茶叶质量监督检验中心，福建 安溪 362400）

用颗粒失重法测定自制微生物发酵液降解马尾松树脂颗粒的效价，探讨了微生物发酵液控制马尾松树脂障碍的可行性。结果表明，树脂颗粒失重量与NaOH滴定量成线性关系，相关系数为0.930。试验优化了失重法的降解条件：颗粒大小0.2 g，发酵液量20 mL，温度60 ℃、pH8下处理12 h。通过5L发酵罐发酵，效价从摇瓶的38.0%提高到50.6%。通过傅里叶红外光谱测定反应前后树脂成分的变化，有羧酸的产生，并且发酵液对树脂类物质中的酯键具有裂解作用，因此该发酵液对树脂障碍有明显控制效果。

失重法 马尾松 树脂颗粒 微生物发酵液 傅里叶红外光谱

0 前言

我国南方造纸厂所用的木材主要是马尾松，而马尾松含有相当高的树脂抽提物，含量甚至可以高达4%以上[1]。由于马尾松树脂会在制浆中，受到物理或化学作用被游离出来，粘附在纸张和生产工艺上，从而造成纸张污点，纸片断头，设备效率降低甚至停机，形成树脂障碍[2-3]。树脂障碍主要是甘油三酸酯(TG）造成的，以它为核心，沉积了其他树脂造成生产上的障碍[4]。

利用酶法可以将树脂水解成游离的脂肪酸和醇类。这两种产物亲水性较强、黏性低。日本是最早用酶控制树脂障碍的国家，来自Candida -cylindracea的脂肪酶对日本红松磨木浆中TG的分解作用达到89%[4]。但是这些酶制剂通常价格昂贵，一定程度上提高了生产成本，所以能够自主开发出具有良好降解树脂障碍的制剂是提高自身竞争力的关键之一。马尾松树脂成分复杂，大多数酶具有专一性，要想自主开发获得具有良好分解树脂作用的酶制剂并不容易。本试验采用自制的微生物发酵液对马尾松树脂的降解作用进行初步探究。

在研究树脂障碍控制过程中, 树脂的定量是该研究必须解决的问题。目前用于测定纸浆中树脂含量的方法主要有：凝胶渗透色谱、薄层色谱、气相色谱、13C 核磁共振光谱、高效液相色谱、紫外-可见光谱、氢氧化钠滴定等[5-6]。本试验室建立的颗粒失重法的原理是微生物制剂直接对树脂颗粒的降解，使颗粒失重，测定其前后失重量。该方法的具有操作简便、速度快等优势，适用于需要大批量测定降解树脂颗粒效价的研究工作。本文初步探讨利用该方法测定自制微生物发酵液对马尾松树脂的降解作用,评价本项目产品微生物处理液控制马尾松树脂障碍的能力。

1 材料与方法

1.1 试验材料

（1）马尾松树脂：福建嘉丰生物化工有限公司。

（2）微生物发酵液。

① 种子培养：从试管斜面中接一环生长良好的菌株至装有100 mL种子培养基的500 mL三角瓶中培养，转速为200 r/min，温度30 ℃，培养12 h。

② 微生物发酵液：菌种本课题组提供，发酵培养基：0.6%酵母粉，0.05%NaNO3，0.45%甘油，1.2% 橄榄油，0.05%MgSO4，0.1%K2HPO4，0.5% 吐温 80，初始pH 8.0。以4%接种量接种发酵培养基，装液量30 mL/250 mL，转速200r/min，30℃下发酵38 h，离心收集发酵上清液。

（3）化学试剂：除溴化钾是光谱纯，其他均为分析纯。

1.2 主要试验仪器

超级恒温槽(上海一恒科技有限公司 MP-501A)，冷冻干燥机（德国Christ ALPHA 2-4 LD PLUS)，旋转蒸发仪(上海亚荣生化仪器厂 RE-52AA)，傅里叶红外光谱（美国 Nicolet 5700），5L发酵罐（德国赛多利斯 BIOSTAT Aplus）。

2 试验方法

2.1 采用颗粒失重法和氢氧化铵（NaOH）滴定法测定微生物发酵液降解树脂颗粒的效价

试验原理：发酵液可以将树脂颗粒水解生成游离的脂肪酸，从而使树脂颗粒质量降低和反应液中的pH下降。将树脂颗粒和发酵液反应一段时间，记录初始和结束时颗粒重量。取3 mL上述反应液和3 mL蒸馏水于一小烧杯中，加一滴酚酞作为指示剂，用0.05 mol/NaOH进行滴定，酚酞变色为终点，记录消耗的NaOH的量，以未进行反应的处理液作为对照。

2.2 用傅里叶红外光谱法分析处理前后树脂的结构变化

按照文献[9]进行。

2.3 发酵液处理树脂颗粒的相关性分析试验

在 250mL 锥形瓶内加入处理液20mL，pH7.6，加入的树脂颗粒质量有0.4、0.8、1.2 g三种，在50 ℃下处理 4、8、17、24、28 h共20组试验。

2.4 发酵液处理树脂颗粒的正交优化

在 250 mL 锥形瓶内加入一颗0.35 g的树脂颗粒，发酵液20 mL，用合适的碱调节 pH 值到 7.6，50℃下处理 12 h。处理完毕后对颗粒进行称重，失重率作为发酵液降解树脂的效果参数。在考察颗粒重量、发酵液量、pH 值和温度对处理效果的影响时，分别只改变对应参数，而其他参数保持不变，如表1所示。并且在做pH对其影响时，用相对应pH的缓冲溶液作为对照。每组试验做三个平行，取平均值。

表1 四种因素所设的变量

2.5 树脂待测样品的处理

发酵液进行硫酸铵分级沉淀，进行透析得到初步纯化的酶液。利用最佳的优化条件进行反应，反应液通过真空冻干机16 h将水分抽干，于500 mL索氏抽提器中用正己烷抽提直到液体颜色不再变化为止，通过直接倒出索氏抽提器提取管中的正己烷进行浓缩，浓缩后的液体于烘箱中烘干，溶解在20 mL的异丙醇中待测[10-11]。

2.6 发酵罐培养试验

5 L小罐中装液量为2.5 L，接种量4%，搅拌速度250 r/min，通风量为1.5 L/min，温度控制在30 ℃，发酵培养时间38 h，发酵液离心取上清液。利用优化后失重法测其降解马尾松树脂的效价。每隔2 h测发酵液的OD600，pH、溶氧电极的在线检测。

3 结果与分析

3.1 颗粒失重法与NaOH滴定法相关性分析

颗粒失重法与NaOH滴定法检测结果，如表2所示。把数据导入SPSS统计分析软件进行相关分析，计算Person相关系数，得出耗NaOH量与颗粒失重的相关系数为0.930，检验的显著性概率为0.000<0.01，拒绝零假设，表明两个变量之间显著相关。

表2 20组耗NaOH量和颗粒失重的相关数据

3.2 颗粒失重法单因素研究

3.2.1 颗粒大小、发酵液用量对降解马尾松树脂的影响

图1显示，树脂颗粒重量在试验范围内，树脂降解率随着树脂颗粒重量的增大而降低，树脂颗粒重量为0.2g时降解率最高。当树脂颗粒质量越小时，酶分子就会与树脂颗粒结合更加充分，所以降解率越高。图2显示，发酵液量在试验范围内，树脂降解率随着发酵液量的增大而增大，发酵液量从10 mL增加到15mL时降解率增幅明显，而25mL到30mL基本没变化。选择最佳的树脂颗粒重量范围为0.2～0.4g，最佳的发酵液量范围为15～25mL。

图1 颗粒大小对降解马尾松树脂的影响

图2 发酵液量对降解马尾松树脂的影响

3.2.2 温度、pH对降解马尾松树脂的影响

图3显示，温度在试验范围内，树脂降解率随着温度的提高而增大，60 ℃时树脂降解率达到最高。由于受到摇床温度的限制，最高只能设置到60 ℃，而60 ℃处还没有下降的趋势，说明发酵液起主导作用的酶可能具有高温酶的特性。在热磨机浆生产过程中，温度达到80 ℃左右，水解酶具有一定的高温作用与耐热性是必备条件[12]。图4显示，pH在试验范围内，pH为8.0时降解率达到最高。主导酶是一种碱性酶，其最适pH值8.0左右。选择最佳的温度范围为40～60 ℃，最佳的pH范围为7～10。

图3 温度对降解马尾松树脂的影响

图4 pH对降解马尾松树脂的影响

3.3 发酵液降解树脂颗粒的正交优化

用 L9（34）正交试验考察了4种因素（pH、树脂颗粒大小、处理液量、温度）对降解率的影响，优选出最佳的酶解工艺。表3中通过极差分析表明，树脂降解的影响作用大小依次为pH 值、颗粒大小、发酵液量及温度。因素优化组合为颗粒大小0.2 g、处理液量20 mL、温度60℃、pH8。从表4中均方差分析表明，C因素为0.806最小，对整个试验结果影响最小，因而把它作为误差估计，用以检验其他因素作用的显著性。结果见表5，由均方差分析可知，pH(D)、树脂颗粒大小（A）对降解率有显著性影响（p<0.05）；且p（D)<0.01， p（A）<0.05，则P(B)对降解率没有显著影响，所以因素主次顺序为D>A>B>C，与极差分析结果相同。

R Squared =0.994 (Adjusted R Squared = 0.976)

表3 正交试验马尾松降解率检测结果

表4 均方差分析

表5 均方差分析表（Tests of Between-Subjects Effects)

3.4 分解树脂的红外光谱分析

制备样品时发现，酶解后的样品相比未处理样品黏度明显降低。处理前后的马尾松树脂类物质的红外光谱分析见图5。从图5和表6中可见，对比处理前后红外谱图，在1 708 cm-1处C=O的伸缩振动，并且在处理后的2图形中，2 929 cm-1处出现了新的振动峰，说明有羧酸产生[9]。那是因为树脂在酶的作用下发生水解产生脂肪酸。C=O的伸缩振动在1708cm-1处，可能是α，β-不饱和羧酸[13]。处理后1708cm-1处C=O伸展振动基团、振动峰明显减弱或消失,表明发酵液对树脂类物质中的酯键的裂解作用。因此发酵液对树脂障碍有明显控制效果[14]。

表6 树脂类物质的红外吸收振动峰和波数

图5 处理前后马尾松树脂类物质的红外谱图

3.5 5L发酵罐培养的发酵液处理试验

3.5.1 发酵罐中菌体的生长情况

从图6中可以看出菌体在6 h后开始进入对数期，发酵液中溶氧也随之急剧下降；到28 h左右开始进入稳定期，溶氧也随之上升。本试验是采用不控制溶氧的方法做的，使得菌体在对数期的DO极低，后续可以采用分段控制溶氧的方法。从图6中的生长曲线可以看出菌体发酵时间可能偏短，后续的试验可以延长发酵时间，并且每隔一段时间进行取样测效价，以便确定最佳的发酵时间。pH从发酵前的8.78一直降到发酵结束的5.97，可以考虑在中途流加碱性物质来维持pH。3.5.2 摇瓶与5 L发酵罐发酵液降解马尾松树脂效价的对比

图6 5 L发酵罐中的PO2、pH和OD600

按失重法最佳组合条件进行效价测定。从表7中可看出，摇瓶的发酵液降解马尾松树脂的效价为38.0%，5L发酵罐的发酵液效价达到50.6%，提升幅度达到33.1%。说明罐上的发酵条件明显优于摇瓶条件，效价也有显著的提高，提示该菌有利于工厂化生产。有报道（叶聿程等）用Enterobacter pulveris.Z75菌株发酵的发酵液并利用失重法测得的效价为23.5%。

表7 摇瓶与5L发酵罐效价的对比

4 结束语

（1）通过NaOH滴定法验证颗粒失重法，相关性系数达到0.930，显著相关，说明颗粒失重法具有可行性。确定了酶解条件的优化方案：颗粒大小0.2 g、处理液量20 mL、温度60 ℃、pH 8，四个因素中对降解率影响作用大小依次为pH值、颗粒大小、处理液量、温度。

（2）通过采用傅里叶红外光谱对反应前后树脂的分析，证实羧酸的产生，并且树脂类物质中的酯键发生裂解。从化学角度验证该微生物发酵液对马尾松树脂的分解作用。

（3）通过5L发酵罐发酵试验，效价从摇瓶的38.0%提高到50.6%。表明本微生物发酵液对马尾松树脂障碍处理的工艺技术，具有良好的应用前景。

[1]陈嘉翔, 秦梦华. 树脂的成分及用脂肪酶消除树脂障碍[J].纸和造纸. 1997(3):40-41.

[2]MENGHUA Q,TEA H,BJARNE H.Physicochemical characterization of TMP resin and relatedmodel mixture [J].Colloids and SurfacesA: Physicochem.Eng. 2003: 243-254.

[3]EKMAN R, ECHERMAN C, HOLMBON B.Studies on the behavior of extractives in mechanical pulpsuspensions[J]. Nordic pulp and paper Research J, 1990, 5(2): 96.

[4]谢来苏.制浆造纸的生物技术[M]. 北京: 化学工业出版社, 2003.

[5]陈建平, 黄儒珠, 吴松刚.碱性脂肪酶水解纸浆中的甘油三酸酯的研究[J].福建师范大学学报, 1998,14(3):72-76.

[6]石海强, 何北海. 紫外-可见光谱测定马尾松纸浆树脂中甘油三酯含量[J]. 光谱学与光谱分析，2007,27(1).

[7]叶聿程, 詹伟, 徐松清, 等.降解天然树脂的微生物分离与筛选[J].中国造纸,2011,30(10).

[8]彭亮, 谢必峰, 张向明. 产复合酶脱墨微生物的筛选与应用[J].中华纸业,2013，34(6).

[9]徐丽丽, 林鹿, 徐晓峰, 等. 脂肪酶结合化学法控制马尾TMP树脂障碍[J]. 中国造纸, 2006, 25( 12) : 4.

[10]S U V I p.Wood Resin in Acacia mangium and Acacia crassicarpa wood and knots[J].Appita,2004,57(2):146.

[11]SUNDBERG K.Preparation and Properties of a ModelDispersion of Colloidal Wood Resin fromNorway Spruce[J].JPPS,1996,22(7):248

[12]詹怀宇. 制浆原理与工程[M].北京:中国轻工业出版社, 2009.

[13]胡皆汉, 郑学仿. 实用红外光谱学[M].北京:科学出版社, 2011.

[14]王松林, 胡惠仁. 机械浆中树脂类物质脂肪酶处理的变化[J]. 中国造纸学报, 2008, 23(1).

福建省造纸学会第五届会员代表大会暨第三届海西纸业论坛召开

福建省造纸学会第五届会员代表大会暨第三届海西纸业论坛于2013年11月24日在福建农林大学学术交流中心召开。出席会议的领导、来宾、代表等共计132人。

开幕式上，福建省造纸学会第四届理事会张道沛名誉理事长代表主办方致辞；中国造纸学会陈学忠理事长、福建省科协游建胜副主席、福建农林大学尤民生副校长、福建省经贸委王建副处长等分别发表热情洋溢的讲话，高度评价会议的召开，并预祝大会取得圆满成功。

福建省轻纺（控股）有限责任公司、福建省纸业协会、《中华纸业》杂志社等单位分别派代表出席会议。福建省民间组织管理局等省内外单位分别以不同的方式向会议召开表示祝贺。

陈学忠理事长希望福建省造纸学会深入学习贯彻中央领导同志对学会工作的重要指示精神，坚持体制创新，努力培养和提高自身的综合素质，推进学会有序承接政府转移的职能。他要求福建省造纸学会必须把这项工作抓紧、抓实、抓好。

第五届会员代表大会分别审议并通过“福建省造纸学会第四届理事会工作报告”、“福建省造纸学会第四届理事会财务报告”、“福建省造纸学会章程修改说明”、“福建省造纸学会章程”、“福建省造纸学会规范化管理文件”。选举产生第五届理事会。

与会同志一致赞同福建省造纸学会今后的职能定位为：组织各种学术交流活动、出版学术期刊、发表学术论文、开展科技教育、承担研究和调研项目、科技中介服务、科技奖励等。

第五届一次理事会分别选出常务理事会和正、副理事长及秘书长。福建农林大学材料工程学院党委书记谢拥群教授当选为第五届理事会理事长，福建农林大学材料工程学院系主任黄六莲教授当选为秘书长；聘任张道沛同志为名誉理事长，沈鸿枝、张仲棠、郑宝琛三位同志为顾问；审议并通过第五届理事会各专业委员会工作条例及下属分支机构、代表机构的管理规定。

福建省纸业协会、芬兰温德造纸湿部技术公司、南纸股份有限公司、福州大学、福建师范大学、西门子公司、厦门鸿益顺环保科技有限公司等单位在论坛上分别作专业报告、学术交流、专题讲座。

Microbial Controlling of the Pinus Massoniana Pitch Trouble

WANG Heng1YE Yucheng2XIE Bifeng1
（1.Biotechnology of Fujian Normal University, Fuzhou, Fujian Province, 350018;2.National Tea Quality Supervision and Inspection Center(Fujian), Anxi 362400, Fujian, China）

Measured the valence of handmade microbial degrading the pinus massoniana resin with particle weightlessness method, discussed the feasibility of microbial fermentation broth controlling the pinus massoniana pitch troubles . Results showed that it was linear dependence between the resin particle weightlessness and the titer of sodium hydroxide. The linearly dependent coefficient was 0.930. The experiment optimized the enzymolysis conditions of weightlessness method: particle size 0.2 g, fluid volume 20 mL, temperature 60°, pH8, processed 12 h . The titer increased from 38% in the shaker to 50.6% through fermenting in the 5Lfermentation tank.The ingredient of resins had changed before and after the reaction measuring by the FT-IR Spectrometer, the carboxylic acid produced, and the fermentation broth had the splitting action to the ester bond among the resin kind material. It can be concluded that this fermentation broth had the obvious control effect on the pitch troubles.

weightlessness method；resin particle；microbial fermentation broth；FT-IR Spectrometer