郑新添，黄翠琴，黄其春，杨小燕，刘建奎

（龙岩学院生命科学学院，福建省人畜寄生与病毒性疫病防控工程技术研究中心，福建龙岩364012）

猪繁殖与呼吸综合征（Porcine reproductive and respiratory syndrome，PRRS），又称“猪蓝耳病”，是由猪繁殖与呼吸综合征病毒（PRRSV）引起的一种以母猪妊娠后期的早产、流产、死胎、木乃伊胎、弱仔等繁殖障碍、新生仔猪的呼吸症状及仔猪的高死率为特征的高度接触性传染病［1］。PRRS是目前影响我国养猪生产的首要病毒性疫病［2］，近年来，以高致病性PRRSV变异株为主要病原的“猪高热综合征”给我国猪场造成严重的损失［3-4］。快速诊断是控制PRRS的关键环节之一，目前PRRSV的检测方法包括病毒分离与鉴定、RT-PCR技术、实时荧光定量RT-PCR技术、免疫荧光技术及血清学方法等［5］。但上述方法也存在一些不足，如病毒分离过程繁琐，PCR检测需要昂贵的设备，血清学诊断不能有效检测病原，因此在临床快速诊断特别是基层兽医临床检测方面均难以满足实际需要。环介导等温扩增（loop-mediated isothermal amplification，LAMP）技术是近年来发展迅速的新型核酸扩增技术。该技术依赖于Bst DNA聚合酶大片段的置换活性，4条特异性引物在65℃下就能对目标基因在1h内完成109～1010个拷贝扩增，结果无需电泳即可通过肉眼观察判断，高特异性、高效性、快速、简便、易检测等特点［6］。LAMP技术目前已广泛应用于人类及动植物细菌、病毒、寄生虫、真菌等病原体的检测［7］。本研究建立了快速检测PRRSV的LAMP技术，为PRRSV的检测提供一种新的手段。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 试验材料 PRRS活疫苗毒（JXA1-R株）及猪瘟活疫苗为齐鲁动物保健品有限公司产品；猪圆环病毒2型（PCV-2）、猪伪狂犬病病毒（PRV）等核酸，来自于预防兽医学与生物技术福建省高等学校重点实验室鉴定的阳性病料。被检临床样品共25份，采集自龙岩学院动物医学研究所接诊的猪只。患猪体温39℃～41℃，厌食、精神不振、呼吸困难，怀孕母猪发生流产、死胎等，结合病理剖检初步判断为PRRS疑似病例，采集患猪肺、淋巴结、脾脏等组织于-70℃冻存备检。

1.1.2 主要试剂 Bst DNA聚合酶大片段为New England Biolabs公司产品；Trizol、DNA Marker、M-MLV反转录酶等为宝生物工程（大连）有限公司产品；SYBR GreenⅠ染料，甜菜碱 （betaine）为Sigma公司产品；组织基因组DNA提取试剂盒为北京百泰克生物技术有限公司产品；其他试剂均为国产分析纯。

1.2 方法

1.2.1 LAMP引物设计与合成 根据GenBank公布的PRRSV的ORF5基因（登录号：DQ475162），对其保守片段应用在线服务器 （https：//primerexplorer.jp/）设计2对特异性引物（表1），其中包括2条外引物F3和B3以及2条内引物FIP和BIP，引物由上海英骏生物技术有限公司合成。

表1 LAMP引物Table 1 Primers of LAMP

1.2.2 核酸的提取及RNA的逆转录 PCV-2、PRV等病毒DNA的提取采用组织基因组DNA提取试剂盒提取，具体步骤参照试剂盒说明书。PRRSV疫苗、猪瘟疫苗及PRRS疑似病料的RNA提取采用Trizol法，操作按试剂盒说明书进行。

cDNA合成反应体系及程序如下：1.5mL离心管中加入M-MuLV 5×buffer 4μL，Rnase Inhibitor（40U/μL ）0.5 μL，M-MuLV Reverse Transcriptase（5U/μL）1μL，random primer 1μL，dNTPs（2.5mmol）1μL，RNA模板5μL，室温下混匀后，42℃水浴1h，冰浴2min，10 000r/min离心30s，即得cDNA，置-20℃保存备用。

1.2.3 PCR法验证2条外引物的准确性 配制25μL的反应体系：2×PCR Master Mix 12.5μL，上、下游引物（F3＋B3）各0.5μL（20pmol/μL ），PRRSV cDNA 1μL，ddH2O 10.5μL。反应条件为：94℃5min；94℃30s，52℃30s，72℃30s，共循环30次；最后72℃5min。反应结束后取5μL扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳分析。对符合预期大小的扩增片段进行测序确认。

1.2.4 LAMP反应体系的建立与优化 建立20μL LAMP反应体系，含外引物（F3、B3），内引物（FIP、BIP）、Betaine、MgSO4、Bst DNA 聚 合 酶、dNTP、Thermopol buffer及PRRSV的cDNA模板等成分。在63℃～65℃下扩增，80℃2min终止反应。取3μL产物进行20g/L琼脂糖凝胶电泳，同时向LAMP产物中加入1μL SYBR GreenⅠ染料，肉眼观察颜色变化。

1.2.5 LAMP特异性试验 采用优化的反应条件，用 CSFV、PCV-2、PRV 核酸作为对照，检测LAMP反应的特异性。

1.2.6 LAMP敏感性试验 将浓度为549ng/μL PRRSV的cDNA进行10倍梯度稀释使其浓度为8个梯度，分别为549、54.9、5.49ng/μL，549、54.9、5.49pg/μL，549、54.9fg/μL ，分 别 取 1μL 进 行LAMP扩增，以检测LAMP的敏感性。

1.2.7 LAMP的临床应用 取临床疑似PRRS病例，提取RNA并逆转录成cDNA后分别用RTPCR法［8］及LAMP技术检测，比较两者的检出率。

2 结果

2.1 引物特异性验证

用LAMP的外引物F3和B3进行普通PCR扩增，电泳结果显示（图1），获得与预期大小一致，约200bp的条带，PCR产物经测序与目标基因的同源性达99%，因此该PCR扩增的为目标基因。

图1 LAMP外引物的验证Fig.1 Verification of outer primers of LAMP

2.2 LAMP反应体系的建立

对LAMP反应体系优化结果表明，LAMP最优体 系 为 20 μL，反 应 液 含 0.2 μmol/L F3，0.2μmol/L B3，1.6μmol/L FIP，1.6μmol/L BIP，1mol/L Betaine，6mmol/L MgSO4，8UBst DNA聚 合 酶，1.6mmol/L dNTP 各 2μL，10×Thermopol buffer及PRRSV的cDNA模板各1μL，加灭菌蒸馏水补至20μL。反应体系在65℃扩增60min，然后80℃作用2min，产物经琼脂糖凝胶电泳呈梯状条带（图2A），产物经SYBR GreenⅠ显色后呈绿色荧光，而阴性呈橙色（图2B）。

图2 LAMP反应结果Fig.2 LAMP reaction results

2.3 特异性试验结果

以PCV-2、PRV及CSFV核酸为对照，在同等条件下进行LAMP扩增，结果表明仅对PRRSV可扩增出特异的梯状条带（图3A）及LAMP产物显示绿色（图3B），而对照中的PCV-2、PRV及CSFV等均无扩增，反应液经染色呈橙色。

图3 LAMP特异性试验Fig.3 Specificity test of LAMP

2.4 敏感性试验结果

对浓度分别为54.9ng/μL～54.9fg/μL 的PRRSV cDNA进行LAMP检测，结果表明在54.9ng/μL～5.49pg/μL可观察到扩增条带，因此，LAMP的检测下限为5.49pg/μL（图4）。

图4 LAMP敏感性试验Fig.4 Sensitivity test of LAMP

2.5 临床检测结果

对25份临床样品分别用常规RT-PCR及LAMP检测PRRSV，结果表明，普通PCR的检出率为64%，LAMP的检出率为72%，LAMP的检出率高于普通PCR。

3 讨论

猪繁殖与呼吸综合征病毒（PRRSV）是一种有囊膜的单股正链RNA病毒，其基因组包含9个ORF，其中ORF5基因编码病毒的囊膜蛋白GP5。PRRSV存在至少2个基因型即美洲型和欧洲型，我国大陆流行的以美洲型为主。不同地方分离的美洲型PRRSV株ORF5基因核苷酸同源性高达95%以上［9］。PRRSV与猪瘟病毒、伪狂犬病毒、圆环病毒等混合感染十分常见［10-11］，在临床和病理上，PRRS与非典型猪瘟等相似，诊断较为困难，尤其以亚临床和慢性发病更为常见［12］。病原检测是PRRS确诊的重要依据，目前基于病原核酸的检测方法，包括PCR（实时定量PCR及普通PCR等）、原位杂交等，但操作较为繁琐，或设备昂贵等不足。环介导等温扩增技术是近年来发展迅速的核酸扩增技术，具有快速、灵敏，操作简单等特点，已广泛应用于动物病原体的检测。

引物设计是LAMP扩增的关键步骤。应用在线设计软件，可针对目标基因设计6条引物，目前LAMP反应体系多以4条引物为主，即2条外引物（F3和B3）和2条内引物（FIP、BIP），本研究针对PRRSV的ORF5保守基因设计了4条LAMP引物。与普通PCR用一对特异性引物扩增目的基因相比，LAMP针对目的基因的6个位点设计4条特异性引物，因此其特异性更高。研究结果显示，本研究建立的LAMP仅对目标基因扩增，而对其他病原体如猪瘟病毒、伪狂犬病病毒及圆环病毒等均无扩增，显示了良好的特异性。

对LAMP体系优化试验表明，该扩增体系反应温度在63℃～65℃扩增结果无明显差异，引物浓度对扩增结果有较大影响，当外引物（F3、B3）与内引物（FIP、BIP）浓度比为1∶8时扩增效果较好；甜菜碱Betaine及Mg2＋的最优浓度分别为1mol/L及6mmol/L。在LAMP的灵敏度评估上，采取cDNA为模板，结果显示该LAMP的检测下限达5.49pg/μL高于普通 RT-PCR检测法［13］，与实时荧光定量RT-PCR法灵敏度相当。对25份临床样品检测，结果表明建立的LAMP检测法比普通PCR法具有更更高的检出率。

此外，LAMP反应中，从dNTPs析出的焦磷酸根离子与反应溶液中镁离子结合，能形成焦磷酸镁沉淀物，出现浑浊沉淀，仅肉眼观察也可判断，该方法优点是LAMP反应结束后不需开盖操作，最大限度降低了污染的可能性，当然在反应结束后再添加SYBR GreenⅠ等染料更易于观察结果。

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