张文婷(综述)，罗飞宏(审校)

(复旦大学附属儿科医院内分泌遗传代谢科，上海 201102)

生长分化因子5(growth differentiation factor-5,GDF-5)，又称骨形态发生蛋白(bone morphogenetic protein,BMP)14或软骨衍生蛋白1，是1994年发现的一种生长因子，其基因由Hötten等[1]从人的cDNA库中首次克隆得到。GDF-5作为胚胎发育、细胞分化、机体软骨形成、骨骼发育等的重要调节因子，近年来受到广泛关注与研究。该文就其作用机制及潜在的作用途径予以综述。

1 GDF-5家族与转化生长因子β超家族

GDF-5隶属转化生长因子β(transforming growth factor-β,TGF-β)超家族，TGF-β家族是一类具有保守结构的二聚体蛋白，含近30个分泌信号分子，已发现9个亚族，另有BMP-2亚族、BMP-5亚族、Vg1亚族、BMP-3亚族、中间成员、活性素亚族、TGF-β亚族和“远房”成员等，共27类因子[2-3]。它们在结构和功能上既有相同点又有不同的特征，主要介导组织的正常生长、发育，包括细胞分化、增殖、迁移和死亡。根据结构和功能指标将其分为三类：TGF-β、激活素、骨形成蛋白。一些分子还可以再分成亚家族[4]，生物活性包括：①作用于早期胚胎使之形成相应组织结构；②刺激形成软骨，骨和性器官；③通过增强血纤溶酶原的催化活性诱导血管形成；④抑制上皮生长；⑤调节重要免疫和内分泌功能；⑥伤口修复等。

2 GDF-5的结构

GDF-5基因定位于20q11.2染色体，全长488 kb，共含有501个氨基酸，包括N端的信号肽，中间的前体肽和C端的成熟肽。翻译后的前体蛋白裂解成为成熟肽，成熟肽发挥生物活性作用，成熟的GDF-5蛋白含120个氨基酸残基，以二聚体形式存在。其成熟蛋白的四级结构主要由7个链间二硫键维持，半胱氨酸残基在决定结构和功能方面至关重要。7个半胱氨酸残基中的任何一个被丝氨酸替代，都可使GDF-5活性显著降低[5]。

3 GDF-5作用机制

GDF-5 mRNA表达主要集中在胚胎软骨间充质细胞聚集区、长骨发育的软骨核以及即将形成关节的区域[6]。在软骨发育初期，GDF-5分泌于肢体骨间质区从而募集软骨前体细胞并促进其分化，之后GDF-5在即将形成关节的区域表达[7]。GDF-5与BMPⅠ型受体及Ⅱ型受体结合，组装成预成型复合体或者BMP介导的信号通路复合体[8-9]。通过形成预成型复合体，BMPⅡ型受体、BMPⅠ型受体A/B亚型受体依次磷酸化而活化，继而作用于R-Smads(Smad1/5/8)使其活化，活化的R-Smads同Smad4形成杂聚肽复合体并进入细胞核特定的DNA区域诱导目的基因的转录。除此之外，GDF-5可以与高亲和力的Ⅰ型受体先行结合，再募集低亲和力的Ⅱ型受体形成BMP介导的信号通路复合体，从而启动不需Smads介导的信号转导，如GDF-5可以通过诱导p38丝裂原活化蛋白激酶的信号转导通路[10-11]。

4 GDF-5与骨修复

GDF-5与富含Ⅰ型胶原组织(如皮质骨)的结构、功能关系密切，GDF-5Bp-J/+鼠在关节炎模型中表现出明显的胶原纤维排列紊乱[12]。GDF-5缺乏的短肢BP小鼠的骨折修复存在1～2周的延迟[13]。

Park等[14]在10只比格犬的两边下颚第2和第4前磨牙周围做出4 mm×5 mm(宽×长)标准大小的深入骨质的缺损，并将它们随机分成两组：一组使用高剂量的人重组GDF-5聚乙丙交酯(poly-lactide-co-glycolide-acid,PLGA)载体(188 μg/缺损)填充与不作填充对照(5只)；另一组进行使用低剂量的重组人生长分化因子5(recombinant human growth differentiation factor5,rhGDF-5)PLGA载体(37 μg/缺损)填充与不含rhGDF-5的载体填充对照。24周后进行免疫组织化学分析得出临床愈合状态不一致，高剂量的rhGDF-5显著增加了骨的形成，促进再生骨的成熟，并且没有异常愈合状况的发生。Leknes等[15]也发现含rhGDF-5的钛移植物可以大幅度提高矿化组织的形成，这种作用与剂量呈正比。

5 GDF-5与软骨生成

Cho等[16]发现在大鼠胫骨骨折的修复过程中，GDF-5仅在第7～14天时表达，并在第7天出现峰值表达，此时正是骨折修复过程的软骨形成期。Coleman等[17]也指出在剔除GDF-5的小鼠的长骨修复过程中，早期骨修复过程存在明显延迟，而骨修复早期是软骨细胞的形成与重构时期。另有报道指出，GDF-5在骨骼发育初期主要是促进软骨祖细胞在一定部位聚集、黏附，后期则能刺激软骨细胞增生、肥大[18]。

Bobacz等[19]在研究肿瘤坏死因子α介导的慢性关节炎模型小鼠时发现，与野生型小鼠相比，转基因鼠在关节软骨区GDF-5和BMP-7的表达下降，软骨细胞对生长因子的应答也呈下降态势，这种下调妨害了组织的修复，同时在滑膜区GDF-5和BMP-7的表达上调，导致了关节滑液囊的肥大，上述的发现说明慢性关节炎的发生与生长因子在软骨区的表达下调和软骨细胞对生长因子反应低下有关。

Alexander等[20]从3位志愿者身上提取了鼻中隔软骨细胞，研究者将软骨细胞在人类血清中扩增，并将其分为两组；一组培养在含2%人类血清的海藻酸盐中，另一组培养在含10%人类血清的海藻酸盐中，同时将胰岛素样生长因子1、BMP-2、BMP-7、BMP-13、GDF-5、TGF-β、胰岛素和地塞米松的不同组合物加入上述培养液中，分别培养2周。2周后，通过测定糖胺聚糖的聚集量，选出聚集最多量糖胺聚糖的胰岛素样生长因子1和GDF-5组进行第二阶段的试验。在第二阶段试验中发现，胰岛素样生长因子1和GDF-5加入2%人类血清组与单纯2%人类血清组相比，胰岛素样生长因子1和GDF-5组可以募集更多的糖胺聚糖和Ⅱ型胶原，生成的软骨厚度是对照组的12倍。

6 GDF-5与脂肪来源间质干细胞分化

体外实验证实，骨髓间充质干细胞在特定培养条件下可以分化为骨细胞、软骨细胞、脂肪细胞和肌肉细胞[21-22]，并且将骨髓间充质干细胞移植至受损伤部位可以加强组织的修复[23-24]。近年来，脂肪间充质干细胞，即脂肪干细胞，因其与骨髓间充质干细胞相似的分化潜能、对特定诱导环境的高反应及来源广泛易于分离提取成为了研究的热点[25-26]。

Zeng等[27]在研究小鼠脂肪间充质干细胞分化为骨细胞的实验中发现，加入了GDF-5的脂肪间充质干细胞培养液，在第4天就可以检测到Cbfa1/Runx2(一种在骨形成早期表达的转化因子)mRNA的高表达，而对照组仅在第14天微弱地表达了该基因，同时von Kossa染色证实GDF-5组矿化作用的证据最充分，同样，GDF-5组上调了碱性磷酸酶(与骨细胞团活性相关)的活性及其基因的水平，以上三点充分说明了GDF-5在脂肪间充质干细胞分化早期即可完全地促进其分化为骨细胞。进一步的研究发现，GDF-5在细胞培养第14天可以显著地上调血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor,VEGF)的基因表达，VEGF在骨分化过程中的具体作用尚不明确，然而有研究证实人重组VEGF-165能刺激骨的形成，提示GDF-5在骨再生方面的作用可能是多方面的[28-29]。

Feng等[30]在研究脂肪干细胞诱导分化为软骨细胞的实验时发现，GDF-5对于促进脂肪干细胞分化为软骨细胞亦有重要作用，与对照组相比较，GDF-5组Ⅱ型胶原蛋白、蛋白聚糖基因(软骨细胞特异性基因)的表达显著增高，且不会促进Ⅰ型胶原蛋白和X型胶原蛋白(软骨细胞肥大的标志)的表达，这种作用以100 μg/L的浓度为最佳。

Park等[31]发现，GDF-5可以促进脂肪间充质干细胞分化为肌腱组织细胞，并且这种作用是时间和浓度依赖性的。肌腱组织细胞外基质、Ⅰ型胶原、蛋白聚糖在100 μg/L GDF-5浓度时表达增加；而另一细胞外基质核心蛋白聚糖在1 μg/L和10 μg/L GDF-5浓度时表达增加。肌腱组织细胞特有的标志物碱性螺旋-环-螺旋转录因子、腱调蛋白在100 μg/L GDF-5浓度时表达增加，而腱生蛋白C的表达在1000 μg/L GDF-5浓度下显著增强。另外，研究还发现一些基质修复蛋白(主要参与肌腱损伤的修复)，如基质金属蛋白酶3及基质金属蛋白酶13的表达在10和1000 μg/L GDF-5浓度时增高，而其抑制蛋白基质金属蛋白酶抑制蛋白2的表达在100 μg/L和1000 μg/L GDF-5浓度时降低，这些蛋白与肌腱受损伤修复相关，说明GDF-5在肌腱损伤修复过程中也起到一定作用。

7 GDF-5与神经元

GDF-5在脑部包括中脑在内的较多区域表达，在腹侧中脑中的表达高峰出现在鼠胚胎第14天，此时多巴胺能神经元正经历终末分化[32]。体外实验证实，经过GDF-5治疗的腹侧中脑部细胞能增加多巴胺能神经元的存活率、改善其形态，并能保护其不受 1甲基4苯基吡啶离子介导的细胞凋亡[33-34]。Toulouse等[35]发现持续的GDF-5治疗可以保护SH-SY5Y细胞免受6-羟多巴胺的神经毒性，这种保护作用可以在加入6-羟多巴胺之前、也可以在其加入之后发挥作用，这为帕金森综合征的治疗提供了一条新的线索。

8 GDF-5的其他作用

将30 μg GDF-5注射入韧带损伤小鼠的膝关节，3周后，胫骨-韧带-股骨复合物的强度增加了41%，硬度增加了60%，说明在韧带损伤修复过程中GDF-5也有一定作用[36]。

有报道指出，在小鼠左心室心肌梗死模型中，GDF-5 mRNA的局部诱导表达在心肌梗死发生后的第7天显著升高。GDF-5剔除的小鼠心肌梗死瘢痕扩大，左心室变大，左心室的弹性变差[37]。

9 结 语

GDF-5有广泛地促进细胞分化的作用，能促使骨折的修复、软骨的生成、修复韧带组织，诱导脂肪细胞来源的间质干细胞分化成骨、软骨和肌腱等组织，在神经系统和心血管系统也表现出一定的保护作用。GDF-5对于组织细胞以及机体干细胞的分化作用还有待于进一步深入研究。

[1] Hötten G,Neidhardt H,Jacobowsky B,etal.Cloning and expression of recombinant human growth/differentiation factor 5[J].Biochem Biophys Res Commun,1994,204(2):646-652.

[2] Massagué J.TGF-β signal transduction[J].Annu Rev Brochem,1998,67:753-791.

[3] Piek E,Heldin CH,Ten Dijke P.Specificity,diversity,and regulation in TGF-β superfamily signaling[J].FASEB J,1999,13(15):2105-2124.

[4] Kingsley DM.The TGF-beta superfamily:new members,new receptors,and new genetic tests of function in different organisms[J].Genes Dev,1994,8(2):133-146.

[5] Schreuder H,Liesum A,Pohl J,etal.Crystal structure of recombinant human growth and differentiation factor 5:evidence for interaction of the type Ⅰ and type Ⅱ receptor-binding sites[J].Biochem Biophys Res Commun,2005,329(3):1076-1086.

[6] Francis-West PH,Abdelfattah A,Chen P,etal.Mechanisms of GDF-5 action during skeletal development[J].Development,1999,126(6):1305-1315.

[7] Pacifici M,Koyama E,Iwamoto M.Mechanisms of synovial joint and articular cartilage formation:recent advances,but many lingering mysteries[J].Birth Defects Res C Embryo Today,2005,75(3):237-248.

[8] Sieber C,Plöger F,Schwappacher R,etal.Monomeric and dimeric GDF-5 show equal type Ⅰ receptor binding and oligomerization capability and have the same biological activity[J].Biol Chem,2006,387(4):451-460.

[9] Heinecke K,Seher A,Schmitz W,etal.Receptor oligomerization and beyond:a case study in bone morphogenetic proteins[J].BMC Biol,2009,7:59.

[10] Nohe A,Hassel S,Ehrlich M,etal.The mode of bone morphogenetic protein(BMP)receptor oligomerization determines different BMP-2 signaling pathways[J].J Biol Chem,2002,277(7):5330-5338.

[11] Hartung A,Bitton-Worms K,Rechtman MM,etal.Different routes of bone morphogenic protein(BMP)receptor endocytosis influence BMP signaling[J].Mol Cell Biol,2006,26(20):7791-7805.

[12] Daans M,Luyten FP,Lories RJ.GDF-5 deficiency in mice is associated with instability-driven joint damage,gait and subchondral bone changes[J].Ann Rheum Dis,2011,70(1):208-213.

[13] Chhabra A,Zijerdi D,Zhang J,etal.BMP-14 deficiency inhibits long bone fracture healing:a biochemical,histologic,and radiographic assessment[J].J Orthop Trauma,2005,19(9):629-634.

[14] Park JC,Wikesjö UM,Koo KT,etal.Maturation of alveolar bone following implantation of an rhGDF-5/PLGA composite into 1-wall intra-bony defects in dogs:24-week histometric observations[J].J Clin Periodontol,2012,39(6):565-573.

[15] Leknes KN,Yang J,Qahash M,etal.Alveolar ridge augmentation using implants coated with recombinant human growth/differentiation factor-5(rhGDF-5).Radiographic observations[J].Clin Oral Implants Res,2012.

[16] Cho TJ,Gerstenfeld LC,Einhorn TA.Differential temporal expression of members of the transforming growth factor beta superfamily during murine fracture healing[J].J Bone Miner Res,2002,17(3):513-520.

[17] Coleman CM,Scheremeta BH,Boyce AT,etal.Delayed fracture healing in growth differentiation factor 5-deficient mice[J].Clin Orthop Relat Res,2011,469(10):2915-2924.

[18] Colenman CM,Tuan RS.Functional role of growth/differentiation factor 5 in chondrogenesis of limb mesenchymal cells[J].Mech Dev,2003,120(7):823-836.

[19] Bobacz K,Sunk IG,Hayer S,etal.Differentially regulated expression of growth differentiation factor 5 and bone morphogenetic protein 7 in articular cartilage and synovium in murine chronic arthritis[J].Arthritis Rheum,2008,58(1):109-118.

[20] Alexander TH,Sage AB,Chen AC,etal.Insulin-like growth factor-Ⅰ and growth differentiation factor-5 promote the formation of tissue-engineered human nasal septal cartilage[J].Tissue Eng Part C Methods,2010,16(5):1213-1221.

[21] Zhou S,Yates KE,Eid K,etal.Demineralized bone promotes chondrocyte or osteoblast differentiation of human marrow stromal cells cultured in collagen sponges[J].Cell Tissue Bank,2005,6(1):33-44.

[22] Chamberlain G,Fox J,Ashton B,etal.Concise review:mesenchymal stem cells:their phenotype,differentiation capacity,immunological features,and potential for homing[J].Stem Cells,2007,25(11):2739-2749.

[23] Banwart JC,Asher MA,Hassanein RS.Iliac crest bone graft harvest donor site morbidity.A statistical evaluation[J].Spine(Phila Pa 1976),1995,20(9):1055-1060.

[24] Silber JS,Anderson DG,Daffner SD,etal.Donor site morbidity after anterior iliac crest bone harvest for single-level anterior cervical discectomy and fusion[J].Spine(Phila Pa 1976),2003,28(2):134-139.

[25] Chen FH,Rousche KT,Tuan RS.Technology Insight:adult stem cells in cartilage regeneration and tissue engineering[J].Nat Clin Pract Rheumatol,2006,2(7):373-382.

[26] Merceron C,Vinatier C,Clouet J,etal.Adipose-derived mesenchymal stem cells and biomaterials for cartilage tissue engineering[J].Joint Bone Spine,2008,75(6):672-674.

[27] Zeng Q,Li X,Choi L,etal.Recombinant growth/differentiation factor-5 stimulates osteogenic differentiation of fat-derived stromal cells in vitro[J].Connect Tissue Res,2006,47(5):264-270.

[28] Zeng Q,Li X,Beck G,etal.Growth and differentiation factor-5(GDF-5)stimulates osteogenic differentiation and increases vascular endothelial growth factor(VEGF)levels in fat-derived stromal cells in vitro[J].Bone,2007,40(2):374-381.

[29] Zelzer E,McLean W,Ng YS,etal.Skeletal defects in VEGF(120/120)mice reveal multiple roles for VEGF in skeletogenesis[J].Development,2002,129(8):1893-1904.

[30] Feng G,Wan Y,Balian G,etal.Adenovirus-mediated expression of growth and differentiation factor-5 promotes chondrogenesis of adipose stem cells[J].Growth Factors,2008,26(3):132-142.

[31] Park A,Hogan MV,Kesturu GS,etal.Adipose-derived mesenchymal stem cells treated with growth differentiation factor-5 express tendon-specific markers[J].Tissue Eng Part A,2010,16(9):2941-2951.

[32] Clayton KB,Sullivan AM.Differential effects of GDF5 on the medial and lateral rat ventral mesencephalon[J].Neurosci Lett,2007,427(3):132-137.

[33] Krieglstein K,Suter-Crazzolara C,Hötten G,etal.Trophic and protective effects of growth/differentiation factor 5,a member of the transforming growth factor-beta superfamily,on midbrain dopaminergic neurons[J].J Neurosci Res,1995,42(5):724-732.

[34] O′Keeffe GW,Dockery P,Sullivan AM.Effects of growth/differentiation factor 5 on the survival and morphology of embryonic rat midbrain dopaminergic neurones in vitro[J].J Neurocytol,2004,33(5):479-488.

[35] Toulouse A,Collins GC,Sullivan AM.Neurotrophic effects of growth/differentiation factor 5 in a neuronal cell line[J].Neurotox Res,2012,21(3):256-265.

[36] Tashiro T,Hiraoka H,Ikeda Y,etal.Effect of GDF-5 on ligament healing[J].J Orthop Res,2006,24(1):71-79.

[37] Zaidi SH,Huang Q,Momen A,etal.Growth differentiation factor 5 regulates cardiac repair after myocardial infarction[J].J Am Coll Cardiol,2010,55(2):135-143.