李锐 柴慧娟 屈扬扬 李丹丹 刘艳丽 张玲

.基础研究.

不同G蛋白耦联受体激酶对β-肾上腺素受体诱导心肌钙/钙调蛋白依赖性蛋白激酶Ⅱ活化的影响

李锐 柴慧娟 屈扬扬 李丹丹 刘艳丽 张玲

目的 探讨不同G蛋白耦联受体激酶(GRK)对β-肾上腺素受体(β-AR)诱导的心肌钙/钙调蛋白依赖性蛋白激酶Ⅱ(CaMKⅡ)活化的影响。方法 雄性小鼠(体质量20～28 g)分为野生对照组(WT:SPF级C57BL/6小鼠，作为阳性对照)、GRK2，3，5，6基因敲除组(GRK2KO、GRK3KO、GRK5KO、GRK6KO)和β1、2-AR突变组［GRK(-):β-AR缺乏GRK磷酸化位点，作为阴性对照］。各组小鼠分别给予异丙基肾上腺素(ISO)刺激或等量生理盐水2周，断颈处死动物，切取左心室并剥离粘连组织，经液态氮处理后贮存于-80℃。Western blot用于检测有活性的CaMKⅡ(p-CaMKⅡThr286/T-CaMKⅡ)的表达变化；采用ELISA方法检测心肌匀浆CaMKⅡ活性；HE染色检测心肌细胞组织学变化。结果 给予ISO刺激后，与阳性对照WT小鼠变化相同，GRK2KO，GRK3KO和GRK6KO小鼠心肌组织中p-CaMKⅡ表达水平明显增加(ISO刺激与非刺激小鼠比较，均为P＜0.05)，而GRK5KO与阴性对照GRK(-)小鼠变化相同，ISO刺激组与非刺激组相比心肌组织中p-CaMKⅡ表达无明显增加；ELISA检测也发现，ISO刺激后WT及GRK2KO，GRK3KO，GRK6KO小鼠心肌组织匀浆的CaMKⅡ活性显著增加(ISO刺激与非刺激小鼠比较，均为P＜0.05)，而GRK5KO及GRK(-)小鼠ISO的CaMKⅡ活性无明显增加。HE染色发现，WT小鼠ISO刺激与非刺激组相比心肌横截面积明显增大［(1388.2±270.3)μm2比(825.5±414.9)μm2，P＜0.05］，GRK5KO小鼠ISO刺激组与非刺激组比较，心肌横截面积无明显差异［(837.1±112.8)μm2比(883.5± 235.9)μm2，P＞0.05］。结论 GRK5对β-AR诱导的CaMKⅡ激活是必要的；GRK5基因敲除可能通过引起CaMKⅡ表达改变而改善β-AR持久兴奋诱导的心肌肥厚。

G蛋白耦联受体激酶； β-肾上腺素受体； 钙/钙调蛋白依赖性蛋白激酶； 心肌肥厚

钙/钙调蛋白依赖性蛋白激酶Ⅱ(calcium/ calmodulin-dependent protein kinaseⅡ，CaMKⅡ)是β-肾上腺素受体(β-adrenergic receptor，β-AR)下游已知的靶信号，其活性和表达在心肌肥厚患者及多种心肌肥厚动物模型的心脏组织中均有明显增加［1］。近来研究表明β1-AR激活，可通过β-AR(βarrestin)的膜转位促进形成β-arrestin-CaMKⅡ的复合体，从而导致CaMKⅡ活性增加［1］。G-蛋白耦联受体激酶(G protein-coupled receptor kinase，GRK)是β-AR信号转导及去敏化的关键调控因子，其磷酸化β-AR后，膜转位的β-arrestin才能与受体有效结合［1-3］。目前共发现7种GRK，其中GRK2，GRK3，GRK5和GRK6在哺乳动物心脏中表达［4-5］。本研究主要探讨体内不同GRK对β-AR诱导的心肌CaMKⅡ活化的影响，并观察其在β-AR持久激动诱发病理性心肌肥厚中的作用。

1 材料与方法

1.1 实验动物及试剂

雄性GRK2，3，5，6基因敲除小鼠(GRK2KO、GRK3KO、GRK5KO、GRK6KO)和β1、2-AR突变小鼠GRK(-)(美国杜克大学医学院惠赠)；SPF级C57BL/6小鼠体质量20～28 g(国家啮齿类实验动物种子中心)；植入式胶囊药物缓释泵(ALZET model-20；Durect Corp.，CA.USA)；异丙肾上腺素(ISO)购自上海禾丰制药有限公司；抗Phospho-CaMKⅡ(Thr286)和GAPDH抗体购自Cell Signaling Technology；抗CaM KinaseⅡ抗体购自BD Transduction LaboratoriesTM；CaMKⅡ活性检测ELISA试剂盒(CY-1173，MBL international Corp.)；辣根过氧化物酶羊抗兔IgG抗体和羊抗鼠IgG抗体购自Jackson公司；Immobilon Western Chemiluminescent HRP Substrate(ECL)购自millopore公司。

1.2 动物分组及标本采集

小鼠分为野生对照组(WT:SPF级C57BL/6小鼠)、GRK2，3，5，6基因敲除组(GRK2KO、GRK3KO、GRK5KO、GRK6KO)和β1、2-AR突变组［GRK (-):β-AR缺乏GRK磷酸化位点］，每组10只。在正常条件(20～25℃、湿度50%～70%、每天12 h光照)下饲养48 h后，各组小鼠分别给予ISO刺激(颈后皮下手术埋藏含β-AR激动剂ISO的植入式胶囊药物缓释泵约20 mg.kg-1.d-1，n=5)或等量生理盐水［非ISO刺激(NS)，n=5］2周。于第2周末断颈处死动物，开胸，迅速剪取心脏并去除大血管及心外膜脂肪组织，用预冷的生理盐水清洗后分离左心室，部分组织于10%中性福尔马林中固定，用于组织学研究；其余组织液氮速冻后转至-80℃保存，用于Western blot及ELISA检测。所有冻存组织均在2周内使用。实验动物所有处置过程符合天津医科大学动物伦理委员会制定的相关标准。

1.3 Western blot检测心肌phospho-CaMKⅡ及total-CaMKⅡ的表达

phospho-CaMKⅡ及total-CaMKⅡ的检测与Mangmool等［1］的方法相同。冻存心肌组织加NP40 lysis buffer冰上匀浆并裂解15 min，4℃、17 500 r/min离心30 min，取上清。BCA法测蛋白浓度。取等量蛋白(150 μg)70℃煮5 min后10%SDS-PAGE电泳分离，电转至PVDF膜。5%脱脂牛奶封闭2 h。分别于抗p-CaMKⅡ(1∶1 000)、抗CaMKⅡ(1∶2 000)及抗GAPDH(1∶5 000)抗体4℃孵育过夜。GAPDH与检验蛋白一起电泳和转膜，后按照其分子量大小沿着marker剪下条带膜，洗膜10 min× 3次，用含HRP标记的相应二抗(1∶5 000)孵育60 min，洗膜10 min×3次，ECL孵育5 min后曝光。凝胶成像分析系统进行密度扫描并分析。

1.4 ELISA方法检测心肌组织CaMKⅡ活性

取冻存的心肌组织按上述方法冰上匀浆并裂解后提取总蛋白，BCA法测蛋白浓度。后续步骤按照试剂盒说明进行操作，最后于酶标仪上读取波长450 nm的OD值。计算各组OD值与加样蛋白量之比值。

1.5 HE染色检测心肌肥厚的组织学变化

10%中性福尔马林固定的左心室组织，常规石蜡包埋，石蜡切片(4 μm)做HE染色。每张切片随机选取10个视野，每个视野选10个细胞(要求尽量呈圆形)，采用图像分析软件IPP 6.0测量横截面积并计算平均值。

1.6 统计学方法

2 结果

2.1 心肌phospho-CaMKⅡ及total-CaMKⅡ的表达

ISO刺激后，WT小鼠、GRK2KO、GRK3KO和GRK6KO小鼠心肌组织中磷酸化CaMKⅡ(p-CaMKⅡ)表达水平明显增加(均为P＜0.05)，而GRK5KO及β-AR突变(阴性对照)小鼠心肌ISO刺激后p-CaMKⅡ的表达无显著增加。CaMKⅡ的激活水平以p-CaMKⅡ与total-CaMKⅡ表达之比表示。GRK2KO、GRK3KO和GRK6KO小鼠ISO刺激与NS组相比心肌p-CaMKⅡ增加的倍数与WT小鼠无明显差异，而GRK5KO小鼠ISO刺激与NS组心肌p-CaMKⅡ增加的倍数明显低于WT小鼠ISO刺激后心肌p-CaMKⅡ增加的倍数(图1)。

图1 ISO刺激与NS小鼠心肌组织p-CaMKⅡ激活水平

2.2 心肌组织CaMKⅡ活性变化

心肌组织匀浆CaMKⅡ活性检测发现，ISO刺激后WT及GRK2KO，GRK3KO和GRK6KO小鼠心肌CaMKⅡ活性明显增加，而GRK5KO及β-AR突变小鼠心肌CaMKⅡ活性未见明显增加(图2)。

2.3 心肌组织学检测结果

根据上述结果，我们认为GRK5对β-AR介导的CaMKⅡ激活是必需的，故对WT及GRK5KO小鼠的心肌进行组织学检测。HE染色显示ISO刺激后，WT小鼠出现明确的心肌肥厚，GRK5KO小鼠心肌与WT小鼠无明显差异，但ISO诱发的心肌肥厚得到明显改善(图3)。WT-ISO组小鼠心肌细胞与WT-NS组相比横截面积明显增大［(1 388.2± 270.3)μm2比(825.5±414.9)μm2，t=3.039，P= 0.016］，GRK5KO-ISO小鼠与GRK5KO-NS小鼠心肌横截面积差异无统计学意义［(837.1±112.8) μm2比(883.5±235.9)μm2，t=-0.395，P= 0.703］。

图2 ISO刺激和NS小鼠心肌组织匀浆CaMKⅡ活性与NS组比较，ISO刺激组aP＜0.05(n=5)

图3 小鼠左心室组织学HE染色结果(×400，n=5)

3 讨论

CaMKⅡ是β-AR下游已知的靶信号，是一种普遍存在于哺乳动物细胞中的丝氨酸/苏氨酸激酶，它由α、β、γ、δ 4种不同的表达基因编码形成6～12个亚基多聚体［6-7］，心肌中主要表达CaMKⅡδ。不同条件下CaMKⅡ的286位苏氨酸(Thr286)被磷酸化，使CaMKⅡ转变为其活性形式。以往研究表明，心肌肥厚患者的心肌组织CaMKⅡ的活性和表达增加；在SHR心肌肥厚模型、主动脉结扎诱导、转基因心肌肥厚动物及心衰动物模型，亦发现CaMKⅡ表达增加［8-11］。持久ISO刺激可使心肌有活性的p-CaMKⅡ表达显著增加，提示β-AR持久兴奋可介导CaMKⅡ激活从而诱发病理性心肌肥厚。

关于β-AR介导心肌CaMKⅡ活化的机制尚有许多不明之处。在心肌β-AR信号转导过程中，GRK是一个关键调控因子。GRKs属于丝氨酸/酪氨酸蛋白激酶，在激动剂与受体结合后，它们磷酸化β-AR，随后膜转位的β-arrestin［2］与受体结合发挥位阻作用，阻断经典的G蛋白/二信使信号(即导致G蛋白介导的信号脱敏)，同时可激活多种下游信号从而引发相应的生物学效应［12］。目前共发现7种GRK，其中GRK2，GRK3，GRK5和GRK6在哺乳动物心脏中表达［4-5］。GRK2、GRK3位于胞浆，而GRK5、GRK6是膜结合蛋白，研究认为GRK2/3的生物学作用与GRK5/6相反［13-14］，表明GRKs的亚家族能够在同一水平产生竞争作用。虽然已经在多种人类疾病如先天性夜盲症、心力衰竭、高血压或关节炎等发现，GRKs表达异常［15-16］，但尚不清楚不同GRK亚型在激动剂诱导的β-AR信号转导途径中作用。我们以往的研究发现，ISO可通过GRKs磷酸化β1-AR，β-arrestin膜转位促进形成β-arrestin/ CaMKⅡ复合体，导致CaMKⅡ活化［1］，提示CaMKⅡ激活与激动剂诱导的GRKs磷酸化β-AR、β-arrestin募集过程密切相关。不同GRK亚型在β-AR介导的心肌CaMKⅡ活化中的作用仍不明确。

本研究结果表明，给予β-AR激动剂ISO刺激后，WT小鼠、GRK2、GRK3和GRK6基因敲除小鼠心肌组织中磷酸化的CaMKⅡ(pCaMKⅡ-T286: CaMKⅡ的活性形式)表达水平明显增加，GRK(-)小鼠由于β-AR上缺乏GRK磷酸化位点，ISO刺激后心肌p-CaMKⅡ表达无显著增加，而GRK5KO小鼠心肌组织中ISO刺激的p-CaMKⅡ增加亦被显著抑制；同时，ELISA方法检测到CaMKⅡ活性变化与上述结果相一致，提示GRK5具有与其他GRKs不同的作用，其对β-AR介导的CaMKⅡ激活是必要的。有研究认为GRK5在病理性心肌肥厚发生中起重要作用［17］，本研究亦发现GRK5KO小鼠ISO诱发的心肌细胞肥厚较WT小鼠得到明显改善，GRK5基因敲除有可能通过抑制p-CaMKⅡ表达上调达到改善β-AR持久兴奋诱导的心肌肥厚，其相关信号转导过程尚有待进一步研究。

本研究以GRKs基因敲除小鼠为研究对象，探讨GRKs对持久激动β-AR介导CaMKⅡ激活的作用及其在β-AR持久激动诱发病理性心肌肥厚中的作用，为临床预防、治疗病理性心肌肥厚及心力衰竭提供新的实验依据。

志谢 美国杜克大学医学院Howard Rockman教授为本研究提供所需的基因敲除小鼠及相关帮助。

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Effect of Gprotein-coup led receptor kinases on β-adrenergic receptor mediated activation of calcium/calmodulin-dependent protein kinaseⅡ

Li Rui，Chai Huijuan，Qu Yangyang，Li Dandan，Liu Yanli，Zhang Ling.
Department of Physiology&Pathophysiology，Basic Medical School，Tianjin Medical University，Tianjin 300070，China

Objective To investigate in vivo whether a certain subset of G protein-coupled receptor kinases(GRKs)is required for β-adrenergic receptor(β-AR)activation of calcium/calmodulin-dependent protein kinaseⅡ(CaMKⅡ)in heart.Methods Male mice(body weight 20-28 g)WT(positivecontrol)，GRK2，3，5，6 knockout and GRK(-)mice(transgenic mice with cardiac-specific overexpression of a mutant β1，2-AR that lacks GRK phosphorylation sites，as negative control)were used in this experiment.Mice were administered with isoproterenol(β-AR agonist，ISO)or saline with the same volume.After sacrificing the mice，left ventricle of the heart were excised and immediately frozen in liquid nitrogen and stored at-80℃for later biochemical assays.Western Blot was used to detect the expression of CaMKⅡ，phospho-CaMKⅡ(Thr286).CaMKⅡactivity of ventricular homogenates was measured by a CaMKⅡassay kit based on ELISA principle.HE staining was used to detect the histological change. Resu lts After ISO administration，the levels of phosphorylated CaMKⅡ(pCaMKⅡ；the active form of CaMKⅡ)were markedly increased in hearts of WT，GRK2，GRK3 and GRK6 knockout mice(ISO-stimulated mice vs.NS mice，all P＜0.05)，whereas ISO-mediated CaMKⅡphosphorylation was markedly blunted in hearts from GRK5 knockout mice，as well as in hearts from GRK(-)mice.Furthermore，CaMKⅡactivity detected by ELISA method in the heart extracts from WT，GRK2，GRK3 and GRK6 knockout mice were significantly increased followed by ISO stimulation(ISO-stimulated mice vs.NS mice，all P＜0.05)，whereas no obvious increase of CaMKⅡactivity was observed in hearts from GRK5 knockout and GRK(-)mice.The myocyte cross-sectional area were significantly increased by ISO stimulation in WT mice［WT-ISO(1 388.2±270.3)μm2vs.WT-NS(825.5±414.9)μm2，P＜0.05］，but not in GRK5 knockout mice［GRK5KO-ISO(883.5±235.9)μm2vs.GRK5KO-NS(837.1±112.8)μm2，P＞0.05］. Conclusions GRK5 provides a specialized function in modulating β-AR stimulated，β-arrestin-mediated CaMKⅡactivity，as well as in developing cardiac hypertrophy in mice heart.

G protein-coupled recepter kinase； β-adrenergic receptor； Calcium/calmodulindependent protein kinase； Cardiac hypertrophy

Zhang Ling，Email:zhanglsl@tijmu.edu.cn

2014-02-15)

(本文编辑:周白瑜)

This work was supported by a grant from the Scientific Research Foundation for the Returned Overseas Chinese Scholars，State Education Ministry of China and Tianjin Medical College Scientific Research Fund(No. 2011ky33)

10.3969/j.issn.1007-5410.2014.04.012

教育部留学回国人员科研启动基金资助项目天津医科大学科学研究基金(2011ky33)

300070天津医科大学基础医学院生理及病生理学系

张玲，电子信箱:zhanglsl@tijmu.edu.cn