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上皮细胞钠离子通道β亚单位基因SCNN1B多态性与原发性高血压的关系研究

2014-03-06王艳玲华琦刘荣坤

中国心血管杂志 2014年4期
关键词:内含子外显子多态性

王艳玲 华琦 刘荣坤

.临床研究.

上皮细胞钠离子通道β亚单位基因SCNN1B多态性与原发性高血压的关系研究

王艳玲 华琦 刘荣坤

目的 研究上皮细胞钠离子通道β亚单位基因SCNN1B羧基端单核苷酸多态性与北京市汉族高血压家系原发性高血压的关系。方法 在北京市汉族常住人群中纳入原发性高血压家系108个(433人),分成高血压患者组(229人)、高血压患者第一代和第二代亲属(血压正常)组(118人)和高血压患者配偶(血压正常)组(86人)。检测生化指标及心电图Sv1+Rv5数值,并分析SCNN1B基因13号外显子及两翼部分单核苷酸多态性。结果 在SCNN1B基因13号外显子的两翼部分符合最小等位基因频率≥5%的位点只有两个即rs3743966(A/T)、rs34618783(A/G)。3组间比较,高血压组的AA/rs3743966基因型频率明显高于其他两组(55.5%比44.9%和32.6%,χ2= 13.768,P<0.01),TT基因型频率明显低于其他两组(9.6%比15.3%和38.3%,χ2=37.205,P<0.01)。rs34618783位点基因型频率在3组间比较,差异无统计学意义。TT/rs3743966纯合子组的收缩压和舒张压水平比AA纯合子组平均低15.69 mmHg和9.14 mmHg,差异有统计学意义(均为P<0.01),其他生化指标在3组间比较差异均无统计学意义(均为P>0.05)。多因素Logistic回归分析显示,TT/rs3743966基因型进入方程(OR:0.239,95%CI:0.117~0.489,P<0.001)。结论 SCNN1B基因rs3743966位点TT基因型可能是北京市汉族高血压家系原发性高血压的保护性因素之一。

上皮细胞钠通道; 基因; 单核苷酸多态性; 原发性高血压

人类上皮细胞钠离子通道(epithelial sodium channel,ENaC)由3个亚单位α、β、γ组成,分别由SCNN1A、SCNN1B、SCNN1G基因编码,属于非电压依赖性通道,主要分布在远端肾单位、结肠远端、肺上皮细胞、腮腺、汗腺,负责钠离子的限速重吸收,对于维持钠的自身平衡、细胞外液量和血压起到重要作用[1]。关于原发性高血压与ENaC基因多态性关系的研究主要集中在β、γ亚单位上,部分结论尚存在争议。编码β或γ亚单位的SCNN1B、SCNN1G基因均含有13个外显子,在第13号外显子附近包含两个富含脯氨酸的区域,第2个区域即为PPPxYxxL结构域,β或γ亚单位突变使该区域缺失可引起Liddle综合征,表明该区域对ENaC通道功能调节的重要性[2-3]。越来越多的证据显示,SCNN1B、SCNN1G基因变异可致遗传性的高血压或低血压,且对血压的影响存在着种族异质性[4]。目前报道的与原发性高血压相关的SCNN1B基因的变异位点均位于C端PPPxYxxL结构域附近,因此本研究纳入中国北方汉族原发性高血压家系,对SCNN1B基因13号外显子及两翼部分进行扩增测序,旨在明确SCNN1B基因与原发性高血压的关系。

1 对象和方法

1.1 研究对象

自2005年1月至2010年9月,在北京市常住汉族人群中纳入原发性高血压家系108个。原发性高血压家系定义为在高血压患者的家庭里,至少连续两代、每一代至少有两人为原发性高血压患者。高血压诊断执行1999年世界卫生组织规定标准。所有入选者均除外继发性高血压、糖尿病、冠心病、甲状腺功能亢进、肿瘤、肾功能不全。共纳入对象433人,年龄36~77岁,平均(50.9±14.9)岁,其中男性197人(45.5%),女性236人(54.5%)。将研究对象分为3组,高血压患者组(229人);高血压患者第一代和第二代亲属(血压正常)组(118人);高血压患者配偶(血压正常)组(86人)。本研究通过首都医科大学宣武医院临床伦理委员会审核同意,所有入选者均已签署知情同意书。

1.2 研究方法

1.2.1 病史采集及体格检查 包括体征测量、血压、心率、心电图检测。体征测量包括身高、体质量、腰围、臀围,均测量2次,取平均值。计算体质指数(body mass index,BMI),BMI=体质量(kg)/身高2(m2)。血压的测量按《中国高血压防治指南》要求进行。家系中疑似高血压者,多次测量血压及站立测量血压,然后由经验丰富的心血管专科医生明确或排除高血压。所有入选者均行心电图检查,计算Sv1+Rv5之和。

1.2.2 生化指标检测 取空腹12 h静脉血,自动生化仪(7060,Hitachi,Japan)检测空腹血糖(FBS)、尿酸、血肌酐、血清总胆固醇(TC)、高密度脂蛋白胆固醇(HDL-C)、三酰甘油(TG)、低密度脂蛋白胆固醇(LDL-C)、血钾和血钠等生化指标。

1.2.3 DNA提取及测序 采用盐析法从白细胞中提取DNA,经鉴定及定量合格后,应用聚合酶链式反应(PCR)扩增SCNN1B基因第13外显子及两翼部分。

上游引物:5’-ATACATTAGTCCCGGCCCTTCT-3’,下游引物:5’-TACCCTCCCGACCCTTTGG-3’。所有PCR产物由上海生物工程技术有限公司应用ABI-Prism 377型遗传分析仪进行基因型自动分析。

1.3 统计学方法

采用SPSS 13.0统计学软件进行数据分析,呈正态分布的计量资料采用±s表示,组间比较采用单因素方差分析ANOVA检验;呈偏态分布的计量资料采用中位数(M)及四分位数间距(QR)表示,组间比较采用Kruskal-Wallis秩和检验;计数资料采用百分构成比表示,两组间比较采用Pearson χ2检验。采用χ2检验评价基因型分布是否符合Hardy-Weinberg平衡(HWE)(以P>0.05为符合HWE)。应用SHEsis软件(http://202.120.7.14/analysis/ myAnalysis.php)来计算遗传标记之间的连锁不平衡程度,衡量值用D'、r2值表示。采用多因素Logistic回归模型调整传统的心血管危险因素(年龄>65岁、性别、吸烟、BMI、腰臀比、血肌酐、FBS、尿酸、TC、TG、LDL-C、HDL-C)后,分析不同基因型与高血压的关系。P<0.05为差异有统计学意义。

表1 高血压家系成员间一般临床资料比较

2 结果

2.1 表型不一致家系成员的一般临床资料比较

高血压患者组年龄、男性比例、吸烟、收缩压、舒张压、BMI、FBS、尿酸、血肌酐、TC、TG和Sv1+Rv5均显著高于亲属组和配偶组(均为P<0.05),3组间心率、腰臀比、HDL-C、LDL-C和血钾、血钠水平差异无统计学意义(表1)。

2.2 SCNN1B基因第13号外显子和两翼部分测序结果

在SCNN1B基因第13号外显子和两翼部分共发现4个多态性位点,分别是rs3743966、rs34618783、rs13306629和rs61759916。符合最小等位基因频率≥5%的位点只有两个即rs3743966 (A/T)、rs34618783(A/G)。rs3743966是一A/T多肽,位于12号内含子且临近PY基序;rs34618783是一G/A多肽,位于11号外显子(图1~3)。AA、AT、TT/rs3743966及AG、GG/rs34618783基因型频率见表2。所有基因型频率均符合Hardy-Weinberg平衡。3组比较,高血压患者组的AA/rs3743966基因型频率明显高于其他两组,TT基因型频率明显较其他两组低。而rs34618783位点基因型在3组间比较,差异无统计学意义。

2.3 rs3743966与rs34618783遗传标记间的连锁不平衡程度分析

SHEsis软件平台用于分析连锁不平衡,发现rs3743966与rs34618783这两个位点不存在连锁不平衡(D’=0.026,r2=0.000)。

表2 3组间基因型频率比较[例(%)]

图1 SCNN1B基因羧基端PCR产物电泳图

2.4 rs3743966位点不同基因型与原发性高血压的关系

将研究对象按不同基因型分为3组,TT纯合子组的收缩压和舒张压水平比AA纯合子组平均低15.69 mmHg和9.14 mmHg,差异有统计学意义(均为P<0.01),而其他生化指标在3组间比较差异无统计学意义(表3)。

表3 rs3743966不同基因型间资料比较

图2 rs3743966位点多态性测序图

图3 rs34618783位点多态性测序图

2.5 不同基因型与原发性高血压的关联分析

采用多因素Logistic回归模型,校正了传统的心血管危险因素(年龄>65岁、性别、吸烟、BMI、腰臀比、血肌酐、FBS、尿酸、TC、TG、LDL-C、HDL-C)后发现,TT/rs3743966基因型作为高血压的保护性因素进入方程(OR:0.239,95%CI:0.117~0.489,P<0.001)。同时年龄>65岁、BMI、血肌酐、TG是本研究中原发性高血压的危险因素(表4)。

表4 原发性高血压的多因素回归分析

3 讨论

人类ENaC在肾脏的远端肾单位高度表达,主要分布在集合管,受醛固酮和血管加压素调节,负责Na+的限速重吸收,对于维持Na+平衡、调节细胞外液容量和血压水平具有重要作用[5]。本研究选取北京市汉族常住人口原发性高血压家系作为研究对象,人口流动性小、人群混居时间长,是一个较好的遗传研究群体。因此在该地区收集高血压家系,比较表型不一致的家系成员的高血压相关的流行病学特征和危险因素,有助于避免分层偏倚。

在家系的一般临床资料比较中可以看到,高血压患者组除收缩压、舒张压外,年龄、男性比例、吸烟、BMI、FBS、尿酸、血肌酐、TC、TG和Sv1+Rv5也均显著高于亲属组和配偶组,这与既往研究类似[6]。本研究中符合最小等位基因频率≥5%的位点只有两个,即rs3743966和rs34618783。所有研究对象在第13号外显子均未发现突变,这与国外研究不同[7]。Dong等[8]曾对186位加纳人进行第13号外显子β-T594M多态性研究,发现加纳人的高血压与β-T594M多态性相关;而Nkeh等[9]采用病例对照研究发现,β-T594M多态性不是影响南非黑人高血压发展及严重程度的重要因素。在所有研究对象中,rs3743966位点A、T等位基因频率分别为0.656和0.344。T等位基因的频率略高于日本人群报道的0.1701,这可能和种族与地区差异相关[10]。

按rs3743966位点AA、AT、TT不同基因型分成的3组比较中可以看到,TT纯合子组的收缩压和舒张压水平比AA纯合子组平均低15.69 mmHg和9.14 mmHg,差异有统计学意义。这类似于Wong等[11]和Harrap等[12]曾在著名的VFHS研究中提到的rs3743966位点与高加索人种原发性高血压家系收缩压相关。

在校正了传统的心血管危险因素后发现,TT/ rs3743966基因型作为高血压的保护性因素进入方程。既往研究已经证实,β或γ亚单位C端的PY基序发生缺失或平截突变后,该基序不能与Nedd4的WW区域结合,抑制了Nedd4与ENaC的结合,通道不能发生遍在蛋白化,阻滞了ENaC的快速内摄和降解,导致顶膜上ENaC数量持续增加并处于持续激活状态,使远端肾单位对Na+重吸收显著增加,从而引起Liddle综合征[13]。rs3743966位点位于第12号内含子且临近PY基序,其对血压的影响可能和它与β或γENaC中的一些尚不明确的突变存在着连锁不平衡,或它与周围存在的其他影响βENaC转录的调节位点间的相互作用有关。这类似于Hannila-Handelberg等[14]的报道,他们在SCNN1B基因第12号内含子中发现i12-17CT这一新变异,且有该变异的患者血浆肾素活性更低。近年越来越多的研究发现,在mRNA剪切过程中,内含子中分支点或内含子与外显子拼接处发生碱基的改变,往往会造成剪切点改变,从而导致编码的蛋白质功能异常[15]。由于内含子的存在使选择剪接成为可能,从而可以由同一个基因产生功能不同甚至相反的蛋白。这或许与本研究中发现的第12号内含子中rs3743966位点多态性与高血压关系的机制有关,当然尚需更大规模的研究及功能表达研究证实。

本研究尚存在一些局限性,如样本例数较少及未行rs3743966位点功能表达研究等,在今后的研究中我们会在更大样本的人群中证实rs3743966位点多态性与原发性高血压的关系。

综上所述,SCNN1B基因第12号内含子rs3743966位点多态性与原发性高血压相关,TT纯合子组的收缩压和舒张压水平明显低于AA纯合子组。rs3743966位点TT基因型是原发性高血压的保护性因素之一。

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Association of epithelial sodium channel β-subunit common polym orphism w ith essential hypertension

Wang Yanling,Hua Qi,Liu Rongkun.
Department of Cardiology,Xuanwu Hospital,Capital Medical University,Beijing 100053,China

Objective To investigate the relationship between common polymorphisms in the C-terminus of SCNN1B gene encoding the β-subunit of epithelial sodium channel(ENaC)and essential hypertension(EH)in Beijing Chinese hypertensive families.M ethods A total of 433 subjects from 108 essential hypertension families were recruited.They were divided into three groups:EH probands(n= 229),first-and second-degree relatives(without EH)of probands(n=118)and spouses(without EH) (n=86).Biochemical indicators,Sv1+Rv5 of ECG and systematic screening of the C-terminus of SCNN1B were performed.Results rs3743966 and rs34618783 satisfied minor allele frequency≥5%were found. Compared with the control subjects,hypertensive patients(probands)were observed with a significantly higher frequency of AA genotype of rs3743966(55.5%vs.44.9%and 32.6%,χ2=13.768,P<0.01) and a significantly lower frequency of TT genotype(9.6%vs.15.3%and 38.3%,χ2=37.205,P<0.01).There were no differences in terms of rs34618783 genotype frequencies among the three groups. Homozygotes for the rarer T allele had on average a 15.69 mmHg lower SBP and a 9.14 mmHg lower DBP than homozygotes for the common A allele(both P<0.01).In multivariable regression analyses,TT genotype of rs3743966 was found to be an independent protective factor of hypertension(OR:0.239,95% CI:0.117-0.489,P<0.001).TT genotype of rs3743966 may be an independent protective factor ofhypertension in Beijing Chinese hypertensive families.

Epithelial sodium channel; Gene; Single nucleotide polymorphism; Essential hypertension

Hua Qi,Email:huaqi5371@medmail.com.cn

2014-03-17)

(本文编辑:谭潇)

10.3969/j.issn.1007-5410.2014.04.003

100053北京,首都医科大学宣武医院心脏科

华琦,电子信箱:huaqi5371@medmail.com.cn

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