周晓峰 王志荣 张卓琦 张超群 徐晤 张涛

.基础研究.

白藜芦醇对持续性心房颤动猪血浆超氧化物歧化酶活性和丙二醛含量的影响

周晓峰 王志荣 张卓琦 张超群 徐晤 张涛

目的 观察白藜芦醇(RES)干预对快速起搏右心房诱发的持续性心房颤动(AF)猪超氧化物歧化酶(SOD)活性和丙二醛(MDA)含量的影响，探讨RES对持续性AF时氧化损伤的抑制作用。方法 18只小家猪(雌雄不拘)按完全随机设计的随机分组方法(采用动物编号和随机分组表)分为起搏组(ATP组，n=6)、假手术组(Sham组，n=6)和RES干预组(n=6)，采用Seldinger血管穿刺技术穿刺右或左侧颈内静脉送入双极电极至右心房并连接至实验用起搏器，快速起搏心房(500次/min)2周(Sham组猪不起搏)制备持续性AF实验模型。RES组猪于起搏前一周开始服用RES (2.5 mg.kg-1.d-1)。用ELISA法检测3组手术前后MDA、SOD水平。结果 (1)起搏前:MDA、SOD值在3组间差异均无统计学意义(均为P＞0.05)。(2)起搏2周后:①与起搏前比较，ATP组和RES组MDA明显升高，SOD降低(均为P＜0.01)；Sham组的差异无统计学意义(均为P＞0.05)；②组间比较，ATP组MDA值明显高于Sham组和RES组(均为P＜0.01)，RES组MDA值稍高于Sham组，但差异无统计学意义(P＞0.05)；ATP组SOD值明显低于Sham组和RES组(均为P＜0.01)，RES组SOD值明显高于ATP组(P＜0.01)，与Sham组比较差异无统计学意义(P＞0.05)。结论 快速起搏右心房诱导的持续性AF猪的氧化应激反应程度明显增高，另外RES可明显减轻持续性AF猪的氧化应激反应。

白藜芦醇； 心房颤动； 氧化应激； 心房起搏

氧化应激反应是指机体内促氧化与抗氧化失衡时，过度氧化导致的细胞损伤。即在机体遭受各种有害刺激时，体内高活性分子如活性氧和活性氮自由基产生过多，氧化程度超出氧化物的清除，氧化系统和抗氧化系统失衡，从而导致组织损伤。心房颤动(atrial fibrillation，AF)是临床常见的心律失常。大量的研究证据提示，AF时氧化应激反应明显增强并可促进AF的发生发展与维持。本课题组前期实验已经证实，通过快速起搏猪右心房能够诱导持续性AF模型，而白藜芦醇(resveratrol，RES)可以降低快速起搏右心房诱导的持续性AF的发生率及持续时间［1］。我们拟通过观察RES干预对快速起搏右心房诱导的持续性AF猪中丙二醛(maleic dialdehyde，MDA)与超氧化物歧化酶(superoxide dismutase，SOD)变化的影响，了解RES降低持续性AF发生的潜在作用机制及其与抗氧化应激保护作用的关系。

1 材料与方法

1.1 材料

SOD试剂盒和MDA试剂盒购自南京建成生物工程有限公司。RES购自湖南省华光生物有限责任公司。实验用猪由徐州医学院实验动物中心提供。AOO型实验用埋藏式起搏器(500次/min)由南京医科大学提供。

1.2 模型制备及电生理检查

18只健康小型家养猪体质量为(37.4± 2.5)kg，月龄2～3个月，按完全随机设计的随机分组方法(采用动物编号和随机分组表)分为3组:起搏组(ATP组，n=6)、假手术组(Sham组，n=6)和 RES干预组(n=6)。随机分组后3组猪的体质量无明显差异(表1)。

ATP组:采用3%戊巴比妥1 ml/kg肌注将猪麻醉后，固定四肢，置于导管床上，颈部备皮(10 cm× 10 cm)以利于穿刺及起搏器的植入。四肢备皮利于贴电极片及心电图的检测。常规消毒铺巾，建立静脉通路，在实验过程中持续静滴0.9%生理盐水(250 ml/h)维持静脉通路和追加麻醉剂。采用Seldinger血管穿刺技术穿刺右侧颈内静脉，经静脉鞘管将一根四极普通标测电极导管送至右心房，定位于冠状窦口处，测定心房有效不应期后，采用Burst法刺激诱发AF，记录AF持续时间。切开右侧颈部皮肤，分离皮下组织，换用8F可撕开鞘管，X线透射下送入“J”形心房电极导管，电极头端固定在右心耳，测量起搏参数满意(电压阈值＜1 V，阻抗500～1 000 Ω)后，将电极尾端与实验用埋藏式体外磁铁控制的高频心脏起搏器相连，心电监护及心电图证实起搏器工作良好后，将起搏器埋于颈部皮下。术中及术后4 d每日给予头孢唑啉钠3.0 g肌肉注射，起搏器的起搏方式为AOO型，起搏频率为500次/min，持续起搏2周，每周记录1次标准肢体导联心电图以检查起搏状态及心电图改变。Sham组:只进行电生理检查，但不予起搏。RES干预组:术前7 d给予RES(2.5 mg.kg-1.d-1)喂养，直到起搏2周后；起搏器的安置同ATP组。

1.3 取材及血浆提取

分别在各组起搏前、起搏两周后抽取静脉血10 ml，置于预先加入抗凝剂和未加入抗凝剂的试管中，4℃冰箱暂保存(不超过24 h)，实验结束后立即用低温离心机1 500 r/min离心15 min，取上清，-20℃冰箱密封保存，待测相关指标。

1.4 血浆MDA的测定

按照MDA试剂盒说明测定。MDA与硫代巴比妥酸缩合产生红色产物，在532 nm处有最大吸收峰，根据比色量测定MDA量。取0.2 ml的血浆样本按照试剂盒说明制成混合匀浆后，用旋涡混匀器混匀，试管口用保鲜膜扎紧，针头刺小孔，95℃水浴40 min，取出后流水冷却，3 500～4 000 r/min离心10 min，吸取上清，532 nm处，1 cm光径，蒸馏水调零，测定各管OD值。计算公式如下:

血浆中MDA含量(nmol/m l)=(测定管吸光度-测定空白管吸光度)/(标准管吸光度-标准空白管吸光度)×标准品浓度(10 nmol/m l)×样本测试前稀释倍数。

1.5 血浆SOD的测定

使用SOD试剂盒测定，取样的枪头为专用且需消毒处理，操作过程中手避免污染。试剂若有结晶则热水浴加热至完全溶解，显色剂由试剂五∶试剂六∶冰乙酸按照3∶3∶2体积配置，配好后需避光冷藏。批量加样之前先摸索最佳取样量，以每毫升反应液中SOD抑制率达到50%(所对应的SOD量为一个活力单位)状态下使用的样品量为以后每次取液量，即最佳取样量。取10 μl血浆样本按照试剂盒说明配成混合制剂后，用旋涡混匀器混匀，37℃恒温水浴40 min，混匀，室温放置10 min，于波长550 nm处，1 cm光径比色杯，蒸馏水调零，测定OD值。血浆中SOD活力计算公式如下:

总SOD活力=(对照管吸光度-测定管吸光度)/对照管吸光度/50%×反应体系的稀释倍数［活力单位定义:每毫升反应液中SOD抑制率达到50%时所对应的SOD量为一个活力单位(U)。］

反应体系稀释倍数=反应液体总量/样品量

1.6 统计学方法

2 结果

2.1 各组MDA活性的变化

(1)起搏前各组血浆中MDA值差异无统计学意义(P＞0.05)；(2)起搏两周后，①与起搏前比较，ATP组和RES组MDA值均升高，但只有Sham组的差异无统计学意义；②组间比较，ATP组MDA值明显高于Sham组和RES组(P＜0.01)，RES组MDA值稍高于Sham组，但差异无统计学意义(P＞0.05) (表1)。

2.2 各组SOD活性的变化

(1)起搏前各组血浆中SOD值差异无统计学意义(P＞0.05)；(2)起搏两周后，①与起搏前比较，3组SOD值均降低，但只有Sham组的差异无统计学意义；②组间比较，ATP组SOD值明显低于Sham组和RES组(P＜0.01)，RES组SOD值明显高于ATP组(P＜0.01)，与Sham组比较差异无统计学意义(P＞0.05)(表1)。

表1 术前和起搏后各组猪血浆MDA、SOD值及体质量比较(±s)

表1 术前和起搏后各组猪血浆MDA、SOD值及体质量比较(±s)

注:与术前比较，aP＜0.01；与ATP组比较，bP＜0.01

组别猪(只) MDA(nmol/ml)SOD(U/ml)体质量(kg)术前起搏两周后术前起搏两周后术前起搏两周后Sham组6 3.260±0.009 3.582±0.323b321.16±9.05 316.85±10.12b37.4±1.6 39.4±2.2 ATP组6 3.257±0.008 14.338±1.449a321.10±9.92 231.86±9.82a38.4±1.4 37.3±1.6 RES组6 3.257±0.008 4.075±0.481ab326.16±9.57 304.52±12.56ab37.6±1.0 38.4±1.4

3 讨论

RES是广泛存在于葡萄、花生、中药虎杖等70多种植物和人类饮食食物中的一种多酚类植物雌激素(或称植物抗毒素)，是目前公认具有心血管保护作用的药物。研究证实，RES可以通过抗氧化、清除氧自由基、增加腺苷释放、促进一氧化氮产生、抗炎、抗细胞凋亡等机制对心血管起保护作用［2］。

AF是目前国内外发病率高，病死率高及高风险的一种慢性心律失常。目前临床上对于AF的治疗效果一直不尽理想，故AF的预防及其作用机制成为目前最热门的研究热点之一。目前大量的研究证据表明AF时氧化应激反应明显增加及增强的氧化应激反应可以促进AF的发生发展与维持［3-4］。增强的氧化应激反应可能通过以下几种主要机制参与AF的发生发展与维持:(1)离子通道功能失调:在AF发生与维持过程中氧化应激可以改变心肌细胞Ca2+通道、钠通道、瞬间外流的钾通道状态，如增多的活性氧可通过直接影响钙调蛋白或间接通过细胞膜脂质过氧化产生细胞内Ca2+超负荷，L型Ca2+通道电流下降，从而参与AF的发生发展与维持［5-6］。(2)NADPH途径:AF时NADPH氧化酶的活性明显增加从而使催化产物氧自由基的产生增加，参与AF的病理发展过程。(3)线粒体损伤:线粒体是氧自由基的重要产生部位，也是氧自由基攻击的主要靶点。氧化应激损伤导致AF患者心房肌组织中细胞线粒体DNA片断缺失增多，这可能是AF发病过程损伤线粒体基因功能紊乱和诱导氧化恶性循环导致的心房肌结构重构的机制，从而促进AF发生发展与维持。本课题组长期研究RES应用于AF预防的作用效果及其潜在的作用机制，前期已经证实RES干预可以降低快速起搏猪右心房诱导的持续性AF的发生率及持续时间［1］，但具体作用机制尚不明确，可能与其抗氧化应激反应有密切联系。

本实验利用RES干预快速起搏猪右心房诱导的持续性AF，然后测定MDA的含量反映机体内脂质过氧化的程度和间接反映出自由基对组织细胞的损伤程度和测定SOD的含量反映自由基的清除能力，旨在探讨AF时氧化应激反应程度及RES干预对持续性AF的抗氧化应激能力。结果表明，快速起搏右心房诱导的持续性AF猪的氧化应激反应程度明显增高，且RES可明显减轻持续性AF猪的氧化应激反应。从而进一步为RES可能通过抗氧化应激作用而降低快速起搏右心房诱导的持续性AF猪的发生发展与维持提供了有力的实验证据。这为RES可以有效预防AF的发生与发展的作用机制提供了一定程度上的理论依据，但其作为AF的预防药物能否应用于临床尚有待于进一步研究，其作用的具体分子机制及信号通路尚不完全清楚，值得本课题组进一步深入研究。

［1］Zhou XF，Wang ZH，Zhang ZQ，et al.Effect of resveratrol on atrial structural remodeling in sustained atrial fibrillation pigs induced by right atrial rapid pacing［J］.Chin J Cardiovasc Med，2013，18:455-458.(in Chinese)周晓峰，王志荣，张卓琦，等.白藜芦醇对快速起搏右心房诱发的持续性心房颤动猪心房结构重构的影响［J］.中国心血管杂志，2013，18:455-458.

［2］Koz ST，Etem EO，Baydas G，et al.Effects of resveratrol on blood homocysteine level，on homocysteine induced oxidative stress，apoptosis and cognitive dysfunctions in rats［J］.Brain Res，2012，1484:29-38.

［3］Kim YM，Kattach H，Ratnatunga C，et al.Association of atrial nieotinamide adenine dinucleotide phosphate oxidase activitv with the development of atrial fibrillation after cardiac surgery［J］.J Am Coll Cardiol，2008，5l:68-74.

［4］Robert B，Heather L，Irfan S，et al.Oxidative stress marker are associated with persistent atrial fibrillation［J］.Clin Chem，2007，53:1652-1657.

［5］Fearon IM，Palmer AC，Balmforth AJ，et a1.Hypoxic and redox inhibition of the human cardiac L-type Ca2+channel［J］.Adv Exp Med Biol，2000，475:209-218.

［6］Korantzopoulos P，Kolettis TM，Kountouris E，et al.Oral vitamin C administration reduces early recurrence rates after electrical cardioversion of persistent atrial fibrillation and attenuates associated inflammation［J］.Int J Cardiol，2005，102:321-326.

Effect of resveratrol on superoxide dismutase activity and maleic dialdehyde content in pigs with sustained atrial fibrillation

Zhou Xiaofeng1，Wang Zhirong2，Zhang Zhuoqi2，Zhang Chaoqun2，Xu Wu2，Zhang Tao3.
1 Department of Master Intensive Care Unit，Shaoxing Women&Children Hospital，Shaoxing 312000，China；2 Department of Cardiology，the First Affiliated Hospital of Xuzhou Medical College；3 Department of Genetic Laboratory，Shaoxing Women&Children Hospital

Objective To observe the effect of resveratrol on superoxide dismutase(SOD)activity and maleic dialdehyde(MDA)content in pigs with sustained atrial fibrillation induced by right tachypacing and investigate the oxidative damage inhibition of resveratrol in sustained atrial fibrillation.Methods Eighteen pigs were randomly divided into three groups for atrial tachypacing(ATP)group(n=6)，resveratrol-intervened(RES)group(n=6)and sham group(n=6)in completely randomized design.The pigs in three groups were all put the pacemakers(AOO)，only the pigs in ATP group and RES group werepaced at 500 beats per minute for 2 weeks.Resveratrol(2.5 mg.kg-1.d-1)were given orally in 3 divided doses，started 7 days prior to ATP onset and continued until the morning of the final open-chest experiment. SOD and MDA content were tested by ELISA.Results (1)Before atrial tachypacing(ATP)，MDA and SOD in all groups were similar(all P＞0.05).(2)After 2 weeks of ATP:①compared with those before ATP in each group，ATP group and RES group changed(MDA increased，SOD decreased)significantly(all P＜0.01)and unsignificantly only in the sham group(all P＞0.05)；②compared with ATP group，RES group showed a decreasing in the concentration of MDA，and showed an increasing in the concentration of SOD(P＜0.01)；compared with RES group and sham group，ATP group showed an increasing in the concentration of MDA，and showed a decreasing in the concentration of SOD(all P＜0.01)，there was no difference between the sham group and the RV group in each indicator(all P＞0.05).Conclusions Oxidative stress reaction was showed markedly in the sustained atrial fibrillation pigs induced by right tachypacing；Resveratrol can significantly inhibit oxidative stress reaction in sustained atrial fibrillation.

Resveratrol； Atrial fibrillation； Oxidative stress； Atrial pacing

Wang Zhirong，Email:xzzrw@163.com

2014-06-15)

(本文编辑:周白瑜)

This work was supported by the grants from Zhejiang Municipal Natural Science Foundation(No. LY12H04001)and the Science and Technology Program of Shaoxing Municipal Science and Technology Bureau(No.2011A23014)

10.3969/j.issn.1007-5410.2014.04.011

浙江省自然科学基金资助项目(LY12H04001)；绍兴市科技局科技计划资助项目(2011A23014)

312000绍兴市妇幼保健院成人重症监护中心(周晓峰)，遗传实验室(张涛)；徐州医学院附属医院心血管病内科(王志荣、张卓琦、张超群、徐晤)

王志荣，电子信箱:xzzrw@163.com