杜志荣，张 琳，阴 彬，彭小忠

（中国医学科学院基础医学研究所，北京 100005）

哺乳动物大脑皮质的发育长期以来都是发育生物学研究的焦点和热点。目前用于研究大脑发育的组织化学技术主要有原位杂交技术和免疫荧光染色，而这些技术均需要前期的标本制备，尤其是取材后的组织固定。组织固定的主要目的是尽可能保持组织内待检测物的原位性、完整性和免疫活性［1］，所以组织固定的效果往往决定着组化实验最终结果的成败。4%多聚甲醛（paraformaldehyde，PFA）因其优良的理化性质成为目前固定标本组织的常用固定剂之一［2－3］，而关于其配制方法，尤其是用于溶解它的溶剂的选择目前还未有定论。本研究以此问题为出发点，比较不同溶剂的4%PFA对鼠脑组织的固定效果，探讨最佳的组织固定方法。

1 材料与方法

1.1 材料:1）实验动物:SPF级怀孕的CD1小鼠，雌性，取材时的孕期分别为 10.5 d（E10.5）、E11.5、E12.5、E16.5d（北京大学医学部实验动物处）。2）化学试剂:0.1 mol/L PB缓冲液（pH 7.4）:81 mmol/L Na2HPO4，19 mmol/L NaH2PO4;0.01 mol/L PBS缓冲液（pH 7.4）:NaCl 137 mmol/L，KCl 2.7 mmol/L，Na2HPO410 mmol/L，KH2PO42 mmol/L（上海生工公司）;PFA（Sigma公司）;Pax6抗体和Ctip2抗体（Abcam公司）;地高辛抗体（Roche公司）。3）RNA探针:所需cDNA均从小鼠大脑中获得，连接于pGEM-3zf载体，利用单酶切线性化质粒，体外转录后再乙醇沉淀回收RNA探针。

1.2 切片制备:1）标本采集:CD1孕鼠断颈处死，剖腹，将胚胎取出后放入预冷的0.9%氯化钠注射液中，E12.5及更早的胚胎整胚固定，E16.5鼠胚取脑，浸入4%PFA（0.01 mol/L PBS或0.1 mol/L PB）固定过夜。第2天用25%蔗糖溶液（0.01 mol/L PBS或0.1 mol/L PB）脱水，24 h后包埋，于－80℃冰箱中冷凝备用。2）切片:以16 μm厚度切片。

1.3 原位杂交:组织切片于4%PFA 20 min，PK缓冲液（2 μg/mL蛋白酶 K）常温 10 min，再 DEPC-4%PFA 10 min，0.1 mol/L三乙醇胺（不含RNA酶）常温搅拌10 min，常温预杂交1 h，65℃杂交过夜（探针终浓度为0.5 ng/μL）;65℃0.2×柠檬酸钠缓冲液 洗20 min ×3次，地高辛抗体1∶5 000，4 ℃孵育过夜;利用四唑硝基蓝/5-溴-4-氯-3-吲哚基-磷酸盐（Roche）系统进行显色反应，使用纯水终止反应，放到100%甲醇中处理20 min，封片，拍照。

1.4 免疫荧光染色:组织切片于1×PBS中浸泡5 min，封闭液室温封闭20～30 min，一抗4℃过夜（一抗稀释比例:Pax6 1∶200，Ctip2 1v500）;1×PBS洗5 min×3次，二抗（1∶200）室温孵育1.5～2 h，PBS洗5 min×3次，DAPI染色，室温3～5 min，1×PBS洗3 min×1次，封片，用Olympus confocal共聚焦荧光显微镜P1000拍照记录。

2 结果

2.1 原位杂交结果:可见4%PFA（0.1 mol/L PB）固定的组织不仅较4%PFA（0.01 mol/L PBS）的致密和形态完好，而且原位杂交背景也明显降低，明显提高了信噪比（图1）。

2.2 免疫荧光染色结果:如图可见，转录因子PAX6蛋白抗体用0.01 mol/L PBS免疫荧光染色的结果更清楚、背景更低;而用0.1 mol/L PB则较模糊和高背景，CTIP2蛋白抗体用0.01 mol/L PBS的非常清晰，而0.1 mol/L PB的结果却几乎不能用于实验分析（图2）。

3 讨论

本实验通过比较两种缓冲系统的PFA固定小鼠大脑组织后的原位杂交、免疫荧光染色的结果的差别，发现0.1 mol/L PB作为溶剂固定的组织更适合原位杂交，而0.01 mol/L PBS更适合于免疫荧光染色。但造成这一差异的具体机制，尚待进一步研究。

总之，为了得到较好的原位杂交和免疫荧光的结果，不仅需要丰富的经验和熟练的技术，而且还要注意根据待固定的组织特性和具体的实验条件来选择不同缓冲系统的固定液。

图1 不同溶剂配制的4%PFA对小鼠胚脑ngn1基因原位杂交结果的影响Fig 1 Effects of different solvent mixture of paraformaldehyde on in situ hybridization results of ngn1 gene in mouse embryo brain（×60）

图2 不同溶剂配制的4%PFA对E16.5小鼠胚脑PAX6、CTIP2蛋白免疫荧光染色结果的影响Fig 2 Effects of different solvent mixture of paraformaldehyde on immunofluorescent staining results of pax6/ctip2 genes in mouse E16.5 brain（×100）

［1］贲长恩，李叔庚.组织化学［M］.北京:人民卫生出版社，2001:10－12.

［2］雷种，成丹丹，王百忍，等.局灶性脑缺血再灌注后大鼠下丘脑pSTAT3阳性神经细胞分布与局部微血管的关系［J］.中华麻醉学杂志，2007，27:827 －830.

［3］Wilcox JN.Fundamental principles of in situ hybridization［J］.J Histochem Cytochem，1993，41:1725 －1733.