李和平 邹 琦 商 兰 刘伟石

(东北林业大学，哈尔滨，150040)

离子载体是指可以整合到细胞膜上，能够转运或通透离子的一类膜活性分子［1］。大多数离子载体是细菌产生的抗生素，其作用机制就是提高了靶细胞膜通透性，使得靶细胞无法维持细胞内离子的正常浓度梯度而死亡，所以离子载体并非是自然状态下存在于膜中的运输蛋白，而是人工用来研究膜运输蛋白的一个概念。与其它多数抗生素不同，由于这一类分子的独特性质，其被广泛用于生物膜功能的研究［1］。

钙离子载体A23187 是一种从微生物中分离出的抗生素，属于游离羧基酸。“精子顶体反应(AR)是Ca2+依赖过程”［2］的发现，导致了钙离子载体(A23187)在精子顶体反应过程中的应用［3］331。A23187 可以结合细胞外的Ca2+、Mg2+等金属阳离子形成复合物，携带离子内流进入精子细胞内，从而诱发精子的顶体反应并激活顶体酶［3］331。自Roldan和Harrison［4］率先采用A23187 处理羊精子引起顶体反应以来，诸多学者曾先后使用A23187 进行了诱发树鼩［5］、狗［6］、小鼠［7］等动物和人［8］精子顶体反应的研究。

本研究以钙离子载体(A23187)诱发马鹿(Cervus elaphus)精子顶体反应，旨在摸索A23187 在体外诱发马鹿精子顶体反应的适宜体系，为鹿的体外繁殖技术提供理论和实践指导。

1 材料与方法

1.1 精液来源

马鹿新鲜精液以人工采精的方法采自黑龙江省农垦科学院哈尔滨特产研究所种鹿场的成年健康种公鹿。采得的新鲜精液用AndroMed 稀释液(德国米尼图公司生产)稀释后，于细管中分装，0 ～4 ℃保存不超过5 d。

1.2 试剂

A23187、BSA、肝素、Penicillin G、Streptomycin sulfate、Na－Pyruvate、Glucose、NaCl、KCl、KH2PO4、NaHCO3、CaCl2·2H2O、MgCl2·6H2O、Na2HPO4·7H2O、NaH2PO4、台盼蓝均购自SIGMA 公司;Phenol Red 购自ALDRICH 公司;DMSO(分装)购自AMRESCO 公司;俾士麦棕Y 购自CHROMA 公司;玫瑰红B、戊二醛、乙醇均为国产分析纯。

1.3 主要操作液

精子体外获能培养液:BO 基础液按照细胞培养用液的要求配制。洗精液为BO 基础液+6 g/L BSA，获能液为BO 基础液+6 g/L BSA+20 mg/L 肝素;各液均为使用前配制，0.22 μm 滤器过滤除菌后，于CO2培养箱(MCO－15AC SANYO)中平衡4 h以上使用;各种培养液均用灭菌超纯水配制。

A23187 配制:A23187 用DMSO 溶解，配制成10 mol/L 浓缩液，－20 ℃保存，使用前逐级稀释至所需浓度;配制过程中注意避光。

染色与固定液:台盼蓝使用体积分数为1%，用BO 基础液充分溶解后，用前离心去除杂质后使用，pH=7.4;俾士麦棕Y 使用体积分数为0.4%，用30%乙醇溶解，调节pH 值至2.8，40 ℃加热使其充分溶解，使用前过滤;玫瑰红B 使用体积分数为0.8%，用0.1 mmol/L Tris 溶解，调节pH 值至5.3，使用前过滤;戊二醛固定液体积分数为3%，用磷酸盐缓冲溶液(PBS)配制，pH=7.4。

1.4 试验方案

采用上浮法，以BSA、肝素诱导精子体外获能;精子获能后，用BO 基础液+6 g/L BSA 将精子悬液稀释至合适浓度，分组，分别加入钙离子载体(A23187)，于CO2培养箱内培养，诱导其发生顶体反应。A23187 诱发精子顶体反应的培养液终浓度分别为0、0.01、0.05、0.10、0.50、1.00、5.00、10.00、50.00、100.00 μmol/L，共10 组，作用时间均为5 min，以筛选 A23187 的适宜浓度。以筛选出的A 23187适宜浓度为基础，继之设计作用时间从0.5、2.0、5.0、7.0、10.0、15.0 min 的6 个组，确定A23187 的适宜作用时间。另外，以筛选出的A23187 适宜作用浓度和时间为基础，将经过离心去除精清和保护剂等成分的精子悬浮于含A23187 的培养液中，研究A23187 诱发未获能马鹿精子顶体反应的效果。

1.5 结果检测与统计处理

采用三色染色法对顶体反应发生的效果进行检测，顶体反应的判断标准参照图1进行。精子顶体反应的检测、顶体反应率的计算及数据统计处理的具体方法按照刘伟石等［9］的方法进行。

图1 马鹿精子顶体反应判断标准参照图

2 结果与分析

2.1 A23187 作用浓度的筛选

由表1可见，添加A23187 后，各组顶体反应率均有所升高;添加终浓度为10 μmol/L A23187 组顶体反应率最高为(77.94±1.35)%，其次是0.10 μmol/L A23187 组为(74.00±2.62)%，但是，精子活率前者(39.38±3.59)%低于后者(78.84±4.25)%，二者精子活率差异显著(P＜0.05)。与对照组(不添加A23187 组)相比较，100.00、50.00、10.00、0.50、0.10、0.05、0.01 μmol/L A23187 组顶体反应率差异显著(P ＜0.05)。随着A23187 浓度的升高，精子活率逐渐下降，与对照组比较0.50、0.10、0.05、0.01 μmol/L A23187 组，差异不显著(P＞0.05)，其他组差异显著(P＜0.05)。

2.2 A23187 作用时间筛选

由表2可见，以0.10 μmol/L A23187 诱发马鹿精子顶体反应，15.0 min 内，顶体反应率先逐渐升高，至5.0 min 时达到最高值，然后又逐渐下降。5.0 min 时，顶体反应率与其他组比较，差异显著(P＜0.05)，其他组之间比较差异不显著(P＞0.05)。

表1 A23187 诱发马鹿精子顶体反应适宜作用浓度的筛选结果

表2 A23187 诱发马鹿精子顶体反应适宜作用时间的筛选结果

2.3 A23187 诱发未获能马鹿精子顶体反应的作用

以含有终浓度为0.10 μmol/L A23187 的BO 基础液处理未获能马鹿精子5.0 min 后，精子顶体反应率为(24.31±3.76)%;获能后，使用0.1 μmol/L A23187 诱导精子顶体反应率为(77.54±0.97)%，二者差异显著(P＜0.05)。

3 讨论

A23187 作用强烈，处理时间过长或浓度过高会导致精子急剧死亡［3］331。诱导精子顶体反应后，如果不去除培养液中的A23187，37 ℃水浴条件下，台盼蓝染色15.0 min，也可能继续诱导精子进行顶体反应的过程。根据离心洗涤精浆去获能因子的方法，在本研究试验方案中，还设计了离心洗涤去除BSA 与A23187，探讨不同处理方法对精子活率和顶体反应率的影响，但本研究结果表明，获能后离心，精子活力变化不大(P＞0.05)。虽然精子顶体反应后比较脆弱，顶体反应后离心，对精子影响很大，精子活力和活率会明显下降［10］，但由于在本试验中计算顶体反应率时，只计算活精子中发生顶体反应的精子数，精子顶体反应后离心，顶体反应率差异不显著(P＞0.05)，离心对顶体反应率无影响。因此，本研究在后续的A23187 作用浓度和时间试验中均采用获能和顶体反应后不离心的方法处理精子。

旭日干等［11］和陈大元［3］332指出用A23187 处理牛、羊精子应不加BSA。A23187 属于羧基酸，BSA参与介导碱性组胺的释放，可能会弱化A23187 的作用。但是，Jaiswal 等［12］使用A23187 诱导人精子顶体反应的结果表明，血清对获能和完全顶体反应是必须的，而对部分顶体反应则不是必须的。本试验方案所使用含有和不含BSA 的获能液使精子获能，A23187 诱导顶体反应后，结果表明二者差异不显著(P＞0.05)，证明BSA 对A23187 诱导顶体反应的弱化作用并不影响马鹿精子顶体反应率，因此本研究的后续试验中均采用含有BSA 的获能液使精子获能。

在其他物种(包括人类)中，已经广泛地使用A23187 诱导精子顶体反应。但是，使用的A23187浓度和诱导时间有很大差异。如Ucar 等［13］用0.1、1.0 μmol/L A23187 孵育羊精子45、60 min，Cao 等［5］用5、10 μmol/L A23187 处理树鼩精子1～2 h，Jaiswal 等［8］使用10 μmol/L A23187 诱导人精子30 min，Picherit－Marchenay 等［14］使用10 μmol/L A23187 孵育人精子45 min，都使精子发生了顶体反应。本试验结果表明，精子获能后，使用0.10、10.00 μmol/L A23187 处理5 min，顶体反应率为74.00%和77.94%，二者比较，差异不显著(P＞0.05)，但与对照组比较，差异均显著(P ＜0.05)，然而10.00 μmol/L A23187 处 理 组，精 子 活 率 低，与0.10 μmol/L A23187 处理后精子活率比较，差异显著(P ＜0.05)。考虑到活率因素，本试验中0.10 μmol/L A23187 比10.00 μmol/L A23187 更适宜做后续的A23187 作用时间和离子转运等精子受精生物学方面的研究。

使用0.10 μmol/L A23187 处理马鹿精子，5 min时顶体反应率最高，与本试验方案中其他作用时间的顶体反应率相比较，差异显著(P＜0.05);其他作用时间之间比较，顶体反应率差异均不显著(P＞0.05)。因此，在后续试验中，A23187 处理马鹿精子时间均采用了5 min。

另外，在本试验中，采用了100.00、50.00 μmol/L 的高浓度A23187 诱导马鹿精子顶体反应，顶体反应率与对照组差异显著(P＜0.05)，该浓度的应用未见报道。但是，100.00、50.00 μmol/L A23187 作用后精子活率明显下降，与其他组差异显著(P＜0.05)。

总之，通过本研究得出:0.01～100.00 μmol/L 的A23187 可提高获能马鹿精子的顶体反应率，其中适宜的A23187 浓度为0.10 μmol/L，且0.10 μmol/L A23187 诱导马鹿精子顶体反应的时间以5 min 为宜。

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