陈彦明　戴凤燕

[摘要] 目的 探讨流式细胞术检测微小残留病（MRD）在儿童急性淋巴细胞白血病（ALL）治疗中的临床价值。 方法 用多种四色荧光抗体组合检测50例正常儿童骨髓，据此建立双参数点图分析模型，500例ALL初发患儿行流式细胞分析，选出异于正常骨髓细胞免疫表型组合来检测MRD，根据确定好的免疫表型组合对105例患儿诱导治疗结束及后续治疗中的骨髓标本行MRD监测，同步行细胞形态学检测和PCR检测。 结果 流式细胞术检出462例有效MRD免疫表型组合，PCR检出142例判断MRD的融合基因或IgH/T淋巴细胞受体基因重排；细胞形态学对诱导治疗后的患儿的MRD阳性检出率为66.67%，流式细胞术的MRD阳性检出率为91.43%。 结论 流式细胞术能对ALL患儿治疗期间的MRD作出准确评估，具有较好的覆盖面和敏感性，值得临床应用。

[关键词] 急性淋巴细胞白血病；微小残留病；流式细胞术

[中图分类号] R733.7 [文献标识码] B [文章编号] 1674-4721（2014）02（a）-0171-03

急性淋巴细胞白血病（acute lymphoblastic leuke- mia，ALL）严重影响患儿健康发育，3～4岁是其高发年龄，发热、贫血、肝脾肿大等是其早期症状。临床报道指出个体化治疗对ALL患者尤为重要[1]，治疗强度应当同其复发风险相适应。微小残留病（minimal residual disease，MRD）是经过诱导化疗或骨髓移植治疗后体内仍残留的白血病细胞形态，它是诱发白血病复发的根源，逐渐被纳入指导个体化治疗的关键性指标[2]。目前聚合酶链反应（polymerase chain reaction，PCR）和流式细胞术是MRD两种检查方法，本研究探讨分析流式细胞术检测MRD在儿童ALL治疗中的临床价值，现报道如下。

1 资料与方法

1.1 一般资料

随机选取2009年1月～2012年12月于本院接受诱导缓解治疗的500例ALL患儿，男性296例，女性204例，年龄1～8岁，平均（4.2±1.2）岁，上述病例经细胞形态学、免疫学、遗传学和分子生物学等方法确诊，B淋巴细胞白血病465例，T淋巴细胞白血病35例。同期行健康检查的正常儿童50例，男性28例，女性22例，年龄1～10岁，平均（4.5±1.5）岁。

1.2 仪器和试剂

主要仪器：O-Rid Cycler定量PCR仪（美国Bio-Rid公司），FACSCalibur 型流式细胞仪（美国BD公司）；D10-藻红蛋白（PE）、CD22-TC、CD13-异硫氰酸荧光素（FITC）、CD38-FITC、CD33-FITC、CD66c（KOR-SA3544）-FITC、CD58-FITC、透膜剂IntraPrep（法国Immunotech公司）；CD45-FITC、CD19-APC、CD33-APC、CD5-PE、CD34-PerCP、HLA-DR-APC、CD3-PerCP、溶血剂FACSLysing（美国Becton Dickin-son公司）；TdT-FITC（美国Supertechs公司）。

1.3 检测方法

采集50例正常儿童的骨髓细胞，通过流式细胞术运用多种四色荧光抗体组合进行检测，建立其双参数点图分析模型，所得结果同文献[3-4]相符。根据正常儿童的双参数点图分析模型对500例ALL初发患儿行流式细胞分析，比较两者的免疫表型组合的差异，选出异于正常骨髓细胞免疫表型组合来检测MRD，对数据进行存档。从中选取诱导治疗结束及后续治疗的患儿的骨髓标本（105例）行流式细胞术，调用先前存档比较相同病例的数据，双参数点图原白血病细胞位置仍出现细胞则可判定白血病残留细胞，残留细胞占骨髓有核细胞总数比例记为MRD检测值。500例患儿同时行细胞形态学检查和PCR检查，按照仪器操作说明进行，将结果同流式细胞术的检测结果进行对比分析。

1.4 统计学方法

采用SPSS 13.0统计学软件进行数据分析，计量资料采用t检验，计数资料采用χ2检验，以P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

流式细胞术检出462例有效MRD免疫表型组合，PCR检出142例判断MRD的融合基因或IgH/T淋巴细胞受体基因重排，两者比较差异有统计学意义（P<0.01）；细胞形态学对诱导治疗后的患儿的MRD阳性检出率为66.67%，35例未检测出MRD，流式细胞术的MRD阳性检出率为91.43%，两者比较，差异有统计学意义（χ2=19.43，P<0.01）。

3 讨论

MRD对儿童ALL的临床疗效和预后判定有重要价值[5]，以往检测MRD的方法包括形态学检查、染色体核型分析、荧光原位杂交技术、异倍体细胞技术等，但上述方法的有效覆盖范围和敏感性均较差，不适于作为MRD的检测手段[6]。随着科技的发展，流式细胞术和PCR逐渐应用于该病灶的检测[7]。成年急性非淋巴细胞白血病的MRD检测中，融合基因覆盖面较广，体内存在也较稳定，因此PCR对其检测效果较好[8]，但儿童ALL的融合基因缺乏特异性，单基因的覆盖面相对较小，因此其在儿童ALL中的应用价值存在一定的局限性[9]。本次检测结果显示500例患儿PCR后仅142例检测出MRD，流式细胞术462例检测出MRD，明显多于PCR，此结果说明流式细胞术具有较广的覆盖面。本研究建立了科学的检测方法，通过异常免疫表型特征与正常细胞间的区别来检测MRD，白血病细胞的某些抗原表达质和量均存在较大的差异，通过抗原表达同正常细胞间的差异就可以对MRD进行区分[10]，联合多种抗原检测更增强了两者间的差异性。本文通过对105例患儿诱导治疗结束及后续治疗中的骨髓标本行MRD监测，进一步证实形态学检查对MRD的敏感性远低于流式细胞术，和相关报道基本相符[11]。白血病治疗过程中部分患者会发生抗原表达改变，因此采取多个免疫表型组合来检查MRD能够较好地避免假阳性[12]。另外需要加强标本的处理，对细胞数、抗体量、孵育时间及离心速度等做到标准化，降低其对检测结果的影响，提高检出效果[13]。

综上所述，流式细胞术能对ALL患儿治疗期间的MRD作出准确评估，具有较好的覆盖面和敏感性，值得临床应用。

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（收稿日期：2013-12-02 本文编辑：魏玉坡）