胡学芳，刘 聪，肖旦望，熊兴华，2*

（1湖南农业大学／作物基因工程湖南省重点实验室，长沙410128；2湖南农业大学油料作物所，长沙410128）

甘蓝型油菜GPAT6基因启动子的克隆与表达载体构建

胡学芳1，刘 聪1，肖旦望1，熊兴华1，2*

（1湖南农业大学／作物基因工程湖南省重点实验室，长沙410128；2湖南农业大学油料作物所，长沙410128）

通过同源PCR克隆的方法，首次从甘蓝型油菜中克隆了甘油-3-磷酸酰基转移酶6（sn-glycerol-3-phosphate acyltransferase6，GPAT6）基因长1 110 bp的启动子，并将其成功构建到植物表达载体pBI121上。重组载体可用于转化拟南芥，探究甘蓝型油菜GPAT6基因的组织表达特征。

甘蓝型油菜；GPAT6基因；启动子；基因克隆；表达载体构建

甘油-3-磷酸酰基转移酶是三酰甘油（Triacylglycerol，TAG）生物合成的关键酶之一［1］，催化TAG生物合成的起始步骤。在拟南芥中已发现10个GPAT基因家族成员［2］，分别命名为ATS1、AtGPAT1、AtGPAT2、AtGPAT3、AtGPAT4、AtGPAT5、AtGPAT6、AtGPAT7、AtGPAT8和AtGPAT9。各成员的定位不同，分别定位于质体GPAT（ATS1）［3］、线粒体GPAT（AtGPAT1／2／3）［4］和内质网GPAT（AtGPAT4／5／6／7／8／9）［2，5］。ATS1主要将酰基从acyl-ACP转移到G-3-P的sn-1位置上形成溶血磷脂酸（Lysophosphatidic acid，LPA）［6～8］，而家族中其他成员则以acyl-CoA为酰基供体［6］。陆生植物特异性GPAT（EC2.3.1.198）能将酰基转移到甘油-3-磷酸的sn-2位上，形成sn-2单酰甘油（sn-2-Monoacylglycerol，sn-2 MAG）［4，9］。溶血磷脂酸在溶血磷脂酸酰基转移酶的作用下得到第二个酰基，形成磷脂酸（Phosphatidic acid，PA）［10］。PA在磷脂酸磷酸酶的作用下，脱去磷酸基团形成二酰甘油（Diacylglycerol，DAG），经二酰甘油酰基转移酶（Diacylglycerol acyltransferase，DGAT）的催化作用产生TAG［11］。

TAG是植物种子储存脂的主要成分。Jain等［12］将红花质体GPAT基因（CtpGPAT）转入拟南芥中超表达，使其种子含油量提高了15%。Gidda等［5］对拟南芥AtGPAT9编码的氨基酸序列进行生物信息学分析，推测其与拟南芥种子含油量有关。此外，GPAT基因家族的功能已在多种植物中展开。有研究证明，拟南芥［3］、菠菜（Spinacia oleracea）［13，14］、豌豆（Pisum sativum）［13，15］等质体GPAT酶对顺9-十八碳烯酸（油酸）的亲和力比较强［16］。抗低温能力弱的植物如南瓜（Cucurbita moschata）质体GPAT酶偏好于饱和脂肪酸［14］。Yan等［17］将甜椒的GPAT基因转入烟草中超表达，提高了烟草耐高温能力。Li等［18］发现，拟南芥gpat5突变体的幼根和种皮中软木脂的含量下降，种子萌发和幼苗成活率显著降低。拟南芥atgpat4／8双突变体的茎和叶中表现出明显的几丁质缺陷［18］，atgpat6突变体的花瓣表现出几丁质缺陷［19］。甘蓝型油菜BnGPAT4干扰系叶片角质层有明显几丁质缺陷，气孔不能正常关闭，使植株长期处于高蒸腾作用状态，容易失水［20］。

油菜是重要的油料作物，在我国具有悠久的栽培历史。目前我国面临对食用油需求的日益增加和全球气候变化带来的干旱、盐碱地面积扩大等问题，如何提高油菜的抗逆性对提高我国油菜单产具有重要意义。研究表明，甘油-3-磷酸酰基转移酶家族与作物的育性［21，22］、种子含油量［12］和抗逆性［17，18，20，23，24］相关。其中拟南芥AtGPAT6与结实率有关。在花药发育阶段，拟南芥AtGPAT6在绒毡层和小孢子中大量表达。在本试验之前笔者已经克隆了甘蓝型油菜GPAT6基因的CDS序列。组织特异性表达及逆境胁迫表明，BnGPAT6基因表达丰度在油菜花中最高，受干旱、高盐以及植物激素的影响。本研究通过同源克隆的方法获得其启动子，并构建植物表达载体，以为揭示GPAT6基因在油菜中的表达特征奠定基础。

1 材料与方法

1.1 试验材料

甘蓝型油菜湘油15号；TransGen生物技术有限公司DNA提取试剂盒、TransTaq DNA Polymerase High Fidelity DNA聚合酶套装、10 mmol／L dNTPs、质粒提取试剂盒、胶回收试剂盒、Hin dIII和Bam HI核酸内切酶以及T4DNA连接酶；TaKaRa生物有限公司的pMD18-T载体；植物表达载体pBI121。其他试剂均为分析纯，购于上海国药。

1.2 试验方法

1.2.1 油菜DNA提取

用TransGen生物技术有限公司DNA提取试剂盒提取湘油15号幼叶DNA，试验步骤参照试剂盒说明书。

1.2.2 引物设计

用油菜BnGPAT6（KC106728）基因的序列在白菜基因组序列中查找同源基因，根据BnGPAT6基因设计基因特异性引物BnGPAT6RS：CGTGGACTAGCTGTTACTATAT，根据白菜GPAT6基因的上游序列设计PCR上游引物Bra017137F： CCCAAGCTTTAACACTTGTGCTGCTATGTCC（下划线处为Hin d III酶切位点）和Bra005137F： CCCAAGCTTTAACACTTGTGCTGCTATGTCC（下划线处为Hin d III酶切位点）。BnGPAT6RS分别与Bra017137F和Bra005137配对进行PCR扩增。

1.2.3 启动子克隆

以油菜基因组DNA为模板，用BnGPAT6RS分别与Bra017137F和Bra005137配对进行PCR扩增。PCR体系20μL：5 U／μL DNA聚合酶0.4μL，10 mmol／L dNTPs 0.4μL，10×PCR缓冲液2μL，50 ng／μL模板2μL，2μmol／L正反引物各2μL，ddH2O 11.2μL。PCR程序：95℃预变性5 min，94℃变性30 s，56℃复性30 s，共35个循环；72℃延伸90 s，72℃保温8 min，16℃恒温。PCR产物经1.0%琼脂糖凝胶电泳，用凝胶成像系统（Bio-Rad）检测和记录结果。将PCR产物回收后与pMD18-T载体连接，转化大肠杆菌感受态细胞，筛选阳性克隆送往华大基因测序，并提取测序成功菌落的质粒。质粒提取方法参照质粒提取试剂盒。

1.2.4 表达载体构建

用MEGA5.0将启动子序列与白菜GPAT6基因的上游序列及甘蓝型油菜GPAT6基因序列进行比对，确定目的序列为BnGPAT6基因启动子序列后，根据其设计下游-引物BnGPAT6RB：CGCGGATCCACAAGAAGAGAAGAGAGAGAGC（下划线处为BamH I酶切位点），以含有目的序列的质粒为模板，用引物Bra017137F与BnGPAT6RB进行PCR扩增。PCR产物经2%的琼脂糖凝胶电泳纯化后，切胶回收。用Hin d III和Bam HI核酸内切酶对目的片段和pBI121质粒进行双酶切。酶切体系为：DNA 10μL、10×K buffer 2μL、Hin d III和Bam HI核酸内切酶各1μL、ddH2O 6μL。将反应体系置于PCR仪中37℃反应4 h。酶切结束后用2%的琼脂糖凝胶电泳纯化反应产物，并回收。用T4连接酶将目的片段连接到切好的pBI载体上。连接体系20μL：载体DNA1μL、目的片段3μL、T4 DNA连接酶1 μL、5×连接缓冲液4μL、ddH2O 11μL。16℃反应12 h。将连接产物转入大肠杆菌DH5α感受态细胞中，挑取抗性菌落进行菌落PCR检测。提取菌落PCR检测阳性菌落的质粒，进行双酶切检测。

2 结果与分析

2.1 启动子的克隆

用BnGPAT6RS分别与Bra017137F和Bra005137配对进行PCR扩增，电泳检测结果（图1）表明，BnGPAT6RS与Bra017137扩增出1 500 bp左右的条带，与预期目的片段大小相符。

图1 PCR产物

将PCR产物回收后与T-vector连接，转化大肠杆菌感受态细胞，筛选阳性克隆进行测序。序列比对结果（图2）显示，目的片段3′-端411个碱基（基因起始密码子及其下游序列）与BnGPAT6基因序列完全一致，5′-端1 110个碱基与白菜Bra017137基因上游序列相似度很高，表明克隆了长度为1 110 bp的BnGPAT6基因启动子。

图2 BnGPAT6基因启动子序列

2.2 表达载体的构建

以含有目的片段的T载体为模板，用引物Bra017137F与BnGPAT6RB进行PCR扩增，纯化回收后进行双酶切，然后用T4连接酶将目的片段连接到植物表达载体pBI121上（图3），转入大肠杆菌DH5α感受态细胞中。挑取抗性菌落进行PCR检测（图4），提取PCR检测阳性菌落的质粒进行双酶切检测（图5）。检测结果表明，BnGPAT6基因启动子成功替换pBI121上的CaMV 35S启动子（图3）。

图3 表达载体结构

图4 菌落PCR检测

图5 双酶切检测

3 结论与讨论

本试验通过同源PCR克隆的方法，克隆了油菜GPAT6基因的启动子，并成功构建到pBI121载体上。

同源克隆是一种比较简单可行的基因克隆方法。本试验通过已经公布的甘蓝型油菜BnGPAT6基因序列和白菜基因组序列设计引物，通过PCR成功克隆BnGPAT6基因的启动子，并将其构建到植物表达载体pBI121上。目前外源基因导入植物的方法多采用农杆菌介导法，这就需要将外源目的基因整合在植物表达载体中。目前使用较多的植物表达载体是双元表达载体，如pBI121、pCAMBIA系列。由于酶切位点的选取限制，本研究选取了pBI121作为表达载体。此外，pBI121载体具有GUS基因，其表达产物既不会影响植物生长，也不会转移。因此，用油菜BnGPAT6基因启动子替换pBI121载体上的CaMV 35S启动子，通过农杆菌介导转入植物中表达，经染色后，能直观地看到BnGPAT6基因启动子的活性及BnGPAT6基因的表达特征。

然而，油菜是异源四倍体植物，在油菜体细胞中，每个基因可能存在多个拷贝。目前已经公布了油菜BnGPAT6基因的两个（KC106728、KJ000117）拷贝，因此，本试验中克隆得到的启动子只是多个拷贝中的1个，其表达活性只能体现KC106728的表达特征。因此，要了解BnGPAT6基因的表达特征，还需弄清油菜中GPAT6基因的拷贝数并获得其启动子，或借助其他的方法做进一步的研究。

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Cloning and Expression Vector Construction of GPAT6 Gene Promoter in Brassica napus

HU Xue-fang1，LIU Cong1，XIAO Dan-wang1，XIONG Xing-hua1，2*
（1 Hunan Agricultural University／Crop Gene Engineering Key Laboratory of Hunan Province，Changsha，Hunan 410128，China；2 Oilseed Crops Institute，Hunan Agricultural University，Changsha，Hunan 410128，China）

In this study，the promoter，1 110 bp in length，of GPAT6 gene was cloned from B.napus at the first time by homology-based PCR cloning，and then itwas constructed to plant expression vector pBI121.The recombinant vector could be transformed into Arabidopsis thaliana to study the tissue expression pattern of GPAT6 gene in B.napus.

Brassica napus；GPAT6 gene；Promoter；Gene cloning；Expression vector construction

Q78；S565.401

A

1001-5280（2014）05-0467-05 DOI：10.3969／j.issn.1001-5280.2014.05.04

2014 04 16

胡学芳（1989-），女，湖南娄底人，硕士研究生，Email：472209985＠qq.com。*通信作者：熊兴华，博士，副教授，Email：xionggene＠yahoo.com。

国家高技术研究发展计划（“863”计划）项目（2012AA101107-3）；湖南省科技厅项目（06FJ4264，07RS4014）。