于海云，姚艳，张银辉，龚菁，黄健，浦介麟

基础与实验研究

不同浓度药物PTC124和G418对HERG通道无义突变体的作用*

于海云，姚艳，张银辉，龚菁，黄健，浦介麟

目的： 通过对HERG基因无义突变体应用不同剂量PTC124和G418来观察其通道功能的恢复情况，并探讨药物的作用机制。

方法： 制备HERG基因R1014X突变体，将野生型（WT）HERG及R1014X分别瞬时转染至HEK293细胞，转染24 h后将其置入含不同浓度的PTC124和G418的培养液中孵育24 h。逆转录聚合酶链反应法检测各组细胞HERG信使核糖核酸（mRNA）的表达，蛋白印迹法检测野生型和R1014X给药前后通道蛋白的表达，全细胞膜片钳技术记录通道电流以评价HERG基因编码通道的功能性表达。

结果：与野生型相比，R1014X突变体编码的通道蛋白的蛋白条带变短，蛋白量及mRNA水平无明显差异（P＞0.05）。药物PTC124和G418均能恢复R1014X完整蛋白的表达，并呈剂量依赖性变化（P＜0.05），PTC124的作用弱于G418（P＜0.05）。药物干预后，R1014X突变体HERG通道的功能得到不同程度的恢复，其最大尾电流密度由（4.75±0.88）pA/pF分别增加至（9.62±0.73） pA/pF （PTC124， P＜0.05）和（22.57±2.26） pA/pF （G418, P＜0.05），G418作用使通道的半激活电压得到恢复（P＜0.05），差异均有统计学意义。

结论： 药物PTC124和G418能不同程度恢复HERG基因无义突变的结构和功能性表达，其恢复HERG基因的蛋白表达呈剂量依赖性变化。

HERG；无义突变； PTC124；遗传性心律失常

Methods: The wide type (WT) and R1014X mutant of HERG gene were transiently transfected into HEK293 cells for 24 hours, and the cells were cultured with pharmaceuticals of PTC124 and G418 at different concentrations respectively for 24 hours. HERG mRNA expression was examined by RT-PCR, HERG WT and R1014X mutant protein expressions were detected by Western blot analysis, HERG channel function was evaluated by patch clamping recorded current fl ow.

Results: Compared with WT HERG, the R1014X mutant showed shorter protein zone in HERG channel protein, while the expressions of mRNA and protein were similar between WT and mutant, P＞0.05. Both PTC124 and G418 may recover the entire protein expression of R1014X mutant in a dose-dependent model, P＜0.05, and the effect of PTC124 was weaken than that of G418, P＜0.05. With pharmaceutical intervention, the R1014X mutant of HERG channel function

may recover at different degrees, the maximal tail current densities of R1014X channels increased from (4.75±0.88 ) pA/pF to (9.62±0.73) pA/pF by PTC124, P＜0.05 and to (22.57±2.26) pA/pF by G418, P＜0.05. The G418 recovered the semi-activation voltage of HERG channels, P＜0.05.

Conclusion: Both pharmaceuticals of PTC124 and G418 could recover the structure and function of HERG channel in nonsense mutation at different degree; they recover HERG channel protein expression in a dose-dependent model.

(Chinese Circulation Journal, 2014,29:461.)

HERG（human ether-a-go-go-related gene）基因编码心脏快速激活延迟整流钾电流（Ikr）通道的α亚基，在心脏复极化过程中具有重要作用[1]。该基因突变可引起Ikr通道电流异常，导致2型长QT 综合征（LQT2）的发生，后者为一类遗传性心律失常，可导致反复发作的晕厥，严重者可导致猝死[2,3]。大约10%的HERG基因突变为无义突变[4,5]，即HERG基因中引入了提前发生的终止密码子（premature termination codons, PTCs），导致蛋白的翻译提前终止生成不完整的功能异常的通道蛋白。

在对囊性纤维化、Duchenne肌发育不良（DMD）等其他无义突变所致疾病的研究中发现氨基糖苷类抗生素可以通过提高CFTR（cystic fibrosis transmembrane conductance regulator）基因、Duchenne肌发育不良基因无义突变体的翻译通过率，产生全长有功能的蛋白，从而恢复突变体的结构和功能[6-8]。我们先前的研究证实药物G418和庆大霉素在表达HERG基因R1014X突变体的HEK293细胞中可以部分恢复HERG样电流[9]，但是药物G418对HERG基因编码通道的恢复是否与剂量相关及发挥最大作用时药物的剂量尚不明确。

PTC124 （Ataluren）是一种新合成的小分子化合物，实验证实它也可以抑制PTCs，使蛋白翻译继续，生成完整的有功能的蛋白质，因此被认为是治疗无义突变所致基因疾病的一种新选择[10]。该化合物在囊性纤维化、Duchenne肌发育不良等无义突变疾病模型中已得到验证[11,12]，但是其在HERG钾通道无义突变中的研究少见报道。

本研究于2012-02至2013-04通过制备HERGR1014X无义突变体并使不同浓度药物（PTC124、G418）作用于该突变体，应用生物化学方法及全细胞膜片钳技术检测给药前后HERG通道蛋白表达和功能的变化，探讨不同药物对HERG基因无义突变体的作用。

1 材料与方法

主 要 试 剂：DMEM（Dulbcco’s Modifed Eagle Medium）高糖培养基、核糖核酸（RNA ）提取试剂TRIzoL Reagent购自美国Invitrogen公司，G418、PTC124购自美国Sigma公司，转染试剂（Ef fectene Transfection Reagent）购自德国 Qiagen 公司，HERG抗 N端及 C 端抗体购自以色列 Alomone公司。BCA试剂盒购自中国碧云天公司。RNA逆转录酶购自瑞士Promega公司， SYBR®GREEN PCR Master Mix购自东洋纺（上海）生物科技有限公司。

HERG基因突变体制备及细胞培养和转染：HERG基因野生型（Wide type, WT）质粒为美国俄勒冈大学周正锋教授赠送，采用聚合酶链反应的方法制备R1014X突变体，并进行基因测序验证序列的正确性。将野生型及R1014X分别瞬时转染至培养的HEK293细胞，转染24 h后将其置入含不同药物浓度的PTC124和G418的培养液中孵育24 h。

实时定量逆转录聚合酶链反应（RT-PCR）检测：Trizol法提取细胞总RNA，以GAPDH为内参进行荧光定量。引物：HERG基因： （上游） 5'-GCTTGCTCAACTCCACCTC-3'， （下游） 5'-TTTGGGGAATCTTGCTAATG-3'；GAPDH： （上游）5'-CCCTTCATT GACCTCAACTACATG-3'，（下游）5'-CTTCTC CATGGTG GTGA AGAC-3'。荧光染料技术行实时定量PCR反应。反应体系（20 µl）包括SYBR®GREEN PCR Master Mix 10 µl、引物（上游0.5 µl、下游 0.5 µl）、超纯水8 µl、互补脱氧核糖核酸（cDNA） 1 µl。反应条件为：94℃ 2 min起始模板变性；94℃ l5 s、58℃ 30 s、72℃ 15 s，共40个循环，计算机分析反应管内荧光强度达到系统设定阈值时的循环数即Ct 值，相对定量法比较野生型及R1014X基因的表达。

蛋白质印迹（Western blot）法检测：提取总蛋

白：使用预冷的PBS缓冲液洗细胞3遍，吸干后加入细胞裂解液（含蛋白酶抑制剂），将细胞刮下移至预冷的EP管，冰上放置20 min后，4℃下13 000 g/ min，离心10 min，将上清转移至新的EP管，BCA法测定蛋白浓度，加loading buffer 70℃温浴5 min。10%SDS-聚丙烯酰胺凝胶恒压电泳，半干法将蛋白转移至硝酸纤维素膜。5%脱脂牛奶封闭1 h后分别加抗HERG N端及C端抗体，4℃孵育过夜；TBST缓冲液冲洗3次，每次5 min，加辣根过氧化酶（HRP）标记的二抗兔抗，室温孵育1.5 h，TBST缓冲液冲洗3次，每次5 min，化学发光法显色，使用Quantity one软件进行灰度值分析。

全细胞膜片钳技术：应用全细胞记录的方式记录给药前后各组细胞HERG电流的表达。细胞外液成分（in mM）：135 NaCl，5 KCl，2 CaCl2，1 MgCl26 H2O，10 glocose，10 HEPES。电极内液（in mM）：140 KCl，0.5 MgCl26 H2O，5 HEPES，2 EGTA，4 K2ATP。记录HERG电流稳态激活I-V的方案为维持电压（Vh）从-80 mV，测试电压（Vt）从-60 mV开始，以10 mV阶跃刺激至+50 mV，继而复极到-50mV记录尾电流，波宽4 000 ms，采样频率2 kHz。实验在室温条件下进行，以pCLAMP 10.0分析采集的电流数据。电流密度以电流值除以细胞电容得出。标准化尾电流后通过Boltzmann公式（I/Imax=1/（1+exp[（V1/2-V）/k]）拟合得到通道的半激活电压（V1/2）和斜率因子（k）。

统计学方法：所有数据应用SPSS13统计软件分析，连续性变量以平均数±标准误的形式表示。两组之间比较采用t检验，组间比较采用ANOVA分析。P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1无义突变影响了HERG基因编码的蛋白表达及HERG通道的功能，转录水平无明显变化

应用HERG基因编码蛋白的N-末端抗体，野生型HERG基因转染细胞内检测出两条蛋白条带，155 kDa和135 kDa的条带分别代表复合糖基化的成熟形式和核心糖基化的未成熟形式；在表达HERG基因R1014X突变体的细胞内也发现了两条分子量低于野生型HERG基因编码蛋白的条带（140 kDa和120 kDa），分别代表成熟和未成熟形式。野生型和R1014X突变体内HERG基因的信使核糖核酸（mRNA）水平的差异无统计学意义，未转染细胞内HERG的mRNA水平几乎检测不到（图1A，P＜0.01），差异有统计学意义。野生型和R1014X突变体转染细胞内HERG基因的蛋白表达量未见明显差异（图1B，P＞0.05）。

图1 野生型及R1014X突变体mRNA及蛋白的表达

全细胞膜片钳技术记录了转染野生型HERG基因和R1014X突变体在HEK293细胞内的电流，R1014X能表达HERG样电流，但是与野生型HERG基因相比，其最大尾电流幅值明显下降[（4.75±0.88） pA/pF， n=7 vs （52.83±4.01） pA/pF, n=10, P＜0.05] ，差异有统计学意义。（图2）

图2 野生型及R1014X突变体电流的表达

2.2不同浓度药物PTC124和G418部分恢复了HERG基因R1014X突变体内HERG全长功能蛋白的表达

为了研究拯救效率，我们应用了HERG基因编码蛋白的C末端抗体。使用该抗体时，只有R1014X突变体得到拯救，135 kDa和155 kDa的两条蛋白条带才能显现，代表着全长功能蛋白表达的

恢复。蛋白质印迹法结果发现：直接检测HERG基因R1014X突变体时，未发现蛋白条带。应用药物PTC124干预后，出现了与野生型一致的蛋白条带，代表着全长功能蛋白的表达，差异具有统计学意义（P＜0.05）；并且，该表达具有剂量依赖性的变化（P＜0.01），随着药物剂量（0、10、50、200 μmol/L）的增加，蛋白的表达也逐渐增加[0、（2.9±0.6）%、（7.6±0.5）%、（10.3±1.0）%]。（图3）

应用药物G418干预后HERG基因编码蛋白的表达也出现剂量依赖性的增加（P＜0.05），在剂量为400 μg/ml时，全长功能蛋白的表达量最多（P＜0.05），差异有统计学意义。（图3）

图3 PTC124和G418对R1014X作用的浓度依赖性

2.3药物PTC124和G418不同程度恢复了R1014X突变体的功能性表达

应用全细胞膜片钳技术检测药物干预后R1014X突变体的电流密度和激活动力学特性的变化：与未处理的突变体[（4.75±0.88 ）pA/pF, n=7]相比，药物 PTC124（200 μg/ml）干预后最大尾电流密度明显增加[（4.75±0.88 ）pA/pF to （9.62±0.73）pA/pF, n=7, P＜0.05]，但是仍然低于野生型HERG基因编码通道[（52.83±4.01）pA/pF, n=10，P＜0.05]，差异有统计学意义。（图4）

药物G418（400 μg/ml）干预后最大尾电流密度也明显增加（22.57±2.26） pA/pF, n=6, P＜0.05）；其激活曲线左移也得到了纠正[V1/2 = （12.05±1.93） mV vs V1/2 =（ 0.20±1.13）mV, P＜0.05]，差异有统计学意义。（图4）

图4 PTC124和G418对R1014X的作用效应

3 讨论

长QT综合征指具有心电图上QT间期延长，T波异常，易产生室性心律失常、晕厥和猝死的一组综合征[13,14]。现已发现13种基因突变可以导致长QT综合征的发生。HERG基因编码通道属于一种进化保守的电压依赖性钾通道Eag家族的成员，是遗传性长QT综合征的致病基因之一。HERG通道是由4个相同的α亚基组成的四聚体组成电压门控性钾通道的典型结构。除了跨膜结构部分，HERG通道还有一个N末端和一个C末端，均位于细胞内。N末端缺失后会导致通道加速灭活，推测其与通道的灭活过程调节有关；C末端从第667位氨基酸残基延伸至第1159 位氨基酸残基，含有环核苷酸结合域（CNBD），与HERG基因编码通道蛋白的成熟和转运有关。本研究中的 HERG基因R1014X突变体为C端突变。R1014X 突变体的C端虽被截短，但仍能表达典型的HERG样电流[15]。我们的研究比较了野生型及R1014X 突变体HERG mRNA的表达，在两组中未见明显差异，说明R1014X突变体mRNA未受到无义突变介导的mRNA降解（NMD效应）[16]，NMD效应是指基因在引入无义突变后显著降低mRNA的稳定性从而引起mRNA的降解[17]。所以，药物G418和PTC124主要是在翻译水平影响蛋白的表达。

氨基糖苷类抗生素是一类历史悠久的抗生素，主要分为两大类：4，5-二脱氧链霉胺衍生物和4，

6-二脱氧链霉胺衍生物，后者主要包括G418、庆大霉素等。体外和体内实验均发现氨基糖苷类抗生素能够提高无义突变的翻译通过率，恢复蛋白的表达和功能[8,18]，课题组前期研究也已证实氨基糖苷类抗生素能够恢复 R1014X 突变体的全长功能蛋白的表达[9]。本研究通过不同剂量的G418作用于R1014X突变体，发现了其作用具有剂量依赖性，随着剂量的加大，恢复能力也逐步增强，进一步证实了氨基糖甙类药物对无义突变体干预的有效性。

氨基糖苷类抗生素在发挥作用的同时，可产生严重的不良反应，其中最严重的是耳毒性和肾毒性。此外，还会产生神经肌肉阻滞作用及变态反应等不良反应，限制了临床上大剂量和长疗程的用药[19]。最近的研究发现PTC124，一种小分子化合物，可以作为新型的无义突变抑制剂产生作用[20,21]。经过PTC124治疗的Duchenne肌发育不良患者和小鼠肌管中可检测出抗肌萎缩蛋白的表达，其用药的浓度小于庆大霉素和G418[10]。我们的研究首次证实PTC124在R1014X突变体中恢复了HERG基因编码全长功能蛋白的合成，并且其发挥作用具有剂量依赖性。

各种药物对于无义突变的拯救具有不同的效率。有研究报道PTC124在治疗囊性纤维化跨膜传导调节因子（CFTR）基因无义突变导致的囊性纤维化的过程中优于庆大霉素和G418等氨基糖苷类抗生素[21]，但也有研究认为PTC124在治疗无义突变导致的代谢性疾病中未发挥明显作用[22]。本研究观察到PTC124对于HERG基因的无义突变有拯救作用，但是效果不及G418。这可能是由于PTC124对不同疾病的无义突变基因存在亲嗜性所致，其具体的作用机制有待于进一步的研究。

总之，本研究首次证实PTC124能部分恢复HERG基因无义突变蛋白的结构和功能，验证了氨基糖苷类抗生素恢复HERG通道的结构具有剂量依赖性的变化。为将来进一步的实验研究奠定了良好基础，也为无义突变所致心律失常的药物治疗带来了新的希望。

[1]Hu CW, Sheng Y, Zhang Q, et al. Curcumin inhibits hERG potassium channels in vitro. Toxicol Lett, 2012, 208: 192-196.

[2]Curran ME, Splawski I, Timothy KW, et al. A molecular basis for cardiac arrhythmia: HERG mutations cause long QT syndrome. Cell, 1995, 80: 795-803.

[3]刘艳， 张新霞，崔长琮. 遗传性长QT间期综合征的研究进展. 中国循环杂志, 2000, 15: 254-256.

[4]Anderson CL, Delisle BP, Anson BD, et al. Most LQT2 mutations reduce Kv11. 1 (hERG) current by a class 2 (trafficking-deficient) mechanism. Circulation, 2006, 113: 365-373.

[5]Splawski I, Shen J, Timothy KW, et al. Spectrum of mutations in long-QT syndrome genes. KVLQT1, HERG, SCN5A, KCNE1, and KCNE2. Circulation, 2000, 102: 1178-1185.

[6]Lee HL, Dougherty JP. Pharmaceutical therapies to recode nonsense mutations in inherited diseases. Pharmacol Ther, 2012, 136: 227-266.

[7]Malik V, Rodino-Klapac LR, Viollet L, et al. Aminoglycoside-induced mutation suppression (stop codon readthrough) as a therapeutic strategy for Duchenne muscular dystrophy. Ther Adv Neurol Disord, 2010, 3: 379-389.

[8]Howard M, Frizzell RA, Bedwell DM. Aminoglycoside antibiotics restore CFTR function by overcoming premature stop mutations. Nat Med, 1996, 2: 467-469.

[9]Yao Y, Teng S, Li N, et al. Aminoglycoside antibiotics restore functional expression of truncated HERG channels produced by nonsense mutations. Heart Rhythm, 2009, 6: 553-560.

[10]Welch EM, Barton ER, Zhuo J, et al. PTC124 targets genetic disorders caused by nonsense mutations. Nature, 2007, 447: 87-91.

[11]Wilschanski M, Miller LL, Shoseyov D, et al. Chronic ataluren (PTC124) treatment of nonsense mutation cystic fibrosis. Eur Respir J, 2011, 38: 59-69.

[12]Goldmann T, Overlack N, Wolfrum U, et al. PTC124-mediated translational readthrough of a nonsense mutation causing Usher syndrome type 1C. Hum Gene Ther, 2011, 22: 537-547.

[13]Crotti L, Celano G, Dagradi F, et al. Congenital long QT syndrome. Orphanet J Rare Dis, 2008, 3: 18.

[14]孙瑞龙. 心血管病与基因突变(2)先天性QT延长综合征. 中国循环杂志, 1999, 14: 195.

[15]Gong Q, Keeney DR, Robinson JC, et al. Defective assembly and trafficking of mutant HERG channels with C-terminal truncations in long QT syndrome. J Mol Cell Cardiol, 2004, 37: 1225-1233.

[16]Brazao TF, Demmers J, van Ijcken W, et al. A new function of ROD1 in nonsense-mediated mRNA decay. FEBS Lett, 2012, 586: 1101-1110.

[17]Palacios IM, Gatfield D, St JD, et al. An eIF4AIII-containing complex required for mRNA localization and nonsense-mediated mRNA decay. Nature, 2004, 427: 753-757.

[18]Zilberberg A, Lahav L, Rosin-Arbesfeld R. Restoration of APC gene function in colorectal cancer cells by aminoglycoside- and macrolideinduced read-through of premature termination codons. Gut, 2010, 59: 496-507.

[19]Nudelman I, Rebibo-Sabbah A, Cherniavsky M, et al. Development of novel aminoglycoside (NB54) with reduced toxicity and enhanced suppression of disease-causing premature stop mutations. J Med Chem, 2009, 52: 2836-2845.

[20]Tan L, Narayan SB, Chen J, et al. PTC124 improves readthrough and increases enzymatic activity of the CPT1A R160X nonsense mutation. J Inherit Metab Dis, 2011, 34: 443-447.

[21]Kerem E, Hirawat S, Armoni S, et al. Effectiveness of PTC124 treatment of cystic fibrosis caused by nonsense mutations: a prospective phase II trial. Lancet, 2008, 372: 719-727.

[22]Ho G, Reichardt J, Christodoulou J. In vitro read-through of phenylalanine hydroxylase (PAH) nonsense mutations using aminoglycosides: a potential therapy for phenylketonuria. J Inherit Metab Dis, 2013, 36: 955-959.

The Pharmaceutical Effects of PTC124 and G418 on Rescuing Nonsense Mutations of HERG GeneChannels

YU Hai-yun, YAO Yan, ZHANG Yin-hui, GONG Jing, HUANG Jian, PU Jie-lin.
State Key Laboratory of Cardiovascular Disease, Cardiovascular Institute and Fu Wai Hospital, CAMS and PUMC, Beijing (100037), China

Objective: To study the pharmaceutical effects of PTC124 and G418 at different doses on rescuing the nonsense mutation of HERG gene channels with its mechanism.

HERG; Nonsense mutation; PTC124; Inherited arrhythmia

2013-11-25)

（编辑：漆利萍）

国家自然科学基金资助项目（No.81070150）

100037 北京市，北京协和医学院 中国医学科学院 阜外心血管病医院 心血管疾病国家重点实验室

于海云 博士研究生 主要从事心律失常基础研究 Email: yhy8702717@163.com 通讯作者：浦介麟 Email：jielinpu@yahoo.com

R541

A

1000-3614（2014）06-0461-05

10.3969/j.issn.1000-3614.2014.06.017