杨树猛，马登录，郭淑珍，李保明，马忠涛，才让闹日，牛小莹，格桂花，赵光平，杨秀兰，张玉珍，尕旦吉，张海滨

（甘肃省甘南州畜牧科学研究所，合作 747000）

遗传育种

藏羊脂联素基因多态性及其与产肉性能的相关性分析

杨树猛，马登录，郭淑珍，李保明，马忠涛，才让闹日，牛小莹，格桂花，赵光平，杨秀兰，张玉珍，尕旦吉，张海滨

（甘肃省甘南州畜牧科学研究所，合作 747000）

利用高分辨率熔解曲线技术对176头2周岁的甘肃藏羊（欧拉型、甘加型、乔科型）脂联素基因SNPs位点进行检测,运用GLM模型将检测到的SNPs位点与部分胴体及肉质性状的相关性进行了分析。结果表明：在脂联素第2外显子发现+67G>C突变使编码氨基酸由谷氨酸突变为谷氨酰胺；GG、GC基因型个体的宰前活重、胴体重均显著高于CC型（P<0.05）。说明脂联素基因该位点可能是影响藏羊胴体及肉质性状的主效QTL或与之紧密连锁,可作为藏羊高档羊肉生产的候选分子标记。

脂联素基因；SNPs；产肉性能；藏羊

脂联素（adiponectin）是脂肪细胞高效表达并通过特殊运输途径分泌进入血液循环的一种活性物质［1］，又被称为ACRP30［2］、ADIPOQ［3］、APM1［4］或GBP28［5］，是迄今为止发现的唯一与肥胖呈负相关的脂肪细胞因子，具有调控葡萄糖、脂肪酸代谢及生物体能量稳态等重要作用。脂联素在生物体内的生理作用通过受体ADIPOR1和ADIPOR2介导［6］。人和哺乳动物脂联素基因均包括3个外显子和2个内含子,而禽类脂联素基因只包括2个外显子和1个内含子［3-4,7］。在人类，脂联素与胰岛素抵抗、动脉粥样硬化之间的相关性已被许多研究者所关注，但对动物脂联素基因的研究相对较少，且主要集中在猪、牛等家畜［8-10］。研究发现该基因可能是控制畜禽脂肪性状的主效基因或与控制该性状的主效基因相连锁，可作为畜禽脂肪性状的候选基因。目前关于羊脂联素基因的研究很少，仅见羊脂联素基因与繁殖性能相关性的报道［11］。

随着全球消费者对绿色食品重要性的认识和需求的日益增加，生活在高海拔无污染地区的甘肃藏羊以生产“绿色肉食品”的独特优势引起国内外的广泛关注。藏羊肉中氨基酸丰富，种类齐全，接近FAO模式，蛋白质品质优良，肌间脂肪含量适中，矿物质含量较高，肉品质量上乘，属于典型的高蛋白、低脂肪、营养丰富的动物性食品，符合现今消费者对肉食品的选择性需求。为合理开发利用和扩大藏羊产品市场，应在提高其生产性能的基础上，加大对其肉品质量的研究。因此，本研究拟采用高分

辨率熔解曲线分析检测脂联素基因第2、3外显子在甘肃藏羊中的多态性，并与肉质性状进行相关性分析，以期寻找控制藏羊肉品质的分子标记位点，为甘肃藏羊的分子标记辅助选择提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 材料 供试羊均为2±0.2周岁母羊，包括欧拉型藏羊53只，来自甘肃省甘南州玛曲县河曲马场；甘加型藏羊57只，来自甘南州夏河县甘加乡核心育种户；乔科型藏羊66只，来自甘南州碌曲县尕海乡核心育种户。血样采自绵羊颈静脉（10 mL/只），用肝素钠抗凝，迅速运回实验室，-70℃冻存备用。屠宰前后对每只羊进行屠体性状分析，屠宰后取背最长肌处肉样，将其分割为100 g左右的小块装入洁净保鲜袋中，迅速冷置于-18℃冰箱冷冻保存，用于肉质品质、风味等分析。测定的主要性状和指标包括宰前活重、胴体重、GR值、眼肌面积、失水力、剪切力，所有检测均参照《绵羊和山羊生产性能测定技术规范》（NYT1236—2006）进行。

1.1.2 主要试剂与仪器 2×Taq PCR Master Mix、血液基因组DNA提取试剂盒均购自天根生化科技（北京）有限公司；LCGreen PLUS饱和荧光染料购自美国Idaho公司；石蜡油购自北京鼎国生物技术有限责任公司；其他常规药品均为国产分析纯。VeritiTM96-Well Thermal Cycler型PCR仪为美国ABI公司产品；Allegra TM21R离心机为美国Beckman公司产品；Lightscanner TMHR-I为美国Idaho公司产品；NanoDrop ND-2000核酸定量仪为美国Nanodrop公司产品。引物合成及测序由宝生物工程（大连）有限公司完成。

1.1.3 PCR引物 根据羊ADIPOQ序列（GenBank登录号：100294598）［11］，用Oligo 6.0设计2对引物，扩增藏羊脂联素基因的第2、3外显子的部分片段。引物序列和扩增片段特征见表1。其中HRM内参核苷酸片段3’端氨基-C6封闭，PAGE级别。

表1 引物序列、产物大小及退火温度

1.2 方法

1.2.1 基因组DNA的提取及定量 按照血液基因组试剂盒说明提取DNA，1%琼脂糖凝胶电泳检测，用NanoDrop ND-2000超微量核酸蛋白检测仪测定其浓度和纯度，PCR前调整样本DNA终浓度至30 ng/μL。

1.2.2PCR扩增 PCR反应体系：10 mmol/L dNTP 0.2 μL，Taq DNA聚合酶0.2 μL，10×PCR反应缓冲液1 μL，0.01 mmol/L上游引物0.1 μL，0.01 mmol/L下游引物0.1 μL，1×LCGreen PLUS饱和荧光染料1 μL，寡核苷酸内参0.2 μL（高温寡核苷酸内参与低温寡核苷酸内参各0.1 μL），模板1 μL（待测模板0.5 μL和野生型模板0.5 μL），加去离子水至10 μL。PCR时于每一体系中加入20 μL的石蜡油，防止液体挥发。PCR反应程序：95℃预变性5 min，然后94℃30 s，58℃退火30 s，72℃30 s，40个循环；最后72℃延伸10 min，4℃保存。

1.2.3 HRM检测 将反应后的8 μL PCR反应产物移至96孔伯乐 PCR平板中，然后加入 10 μL矿物油，1 000 r/min离心。LightScanner仪器从45℃开始，以0.3℃/s的斜率采集熔解曲线，到 98℃结束，用LightScanner Call IT软件对采集后的曲线进行分析。

1.2.4 测序 选择基因型不同的样品，送大连宝生物工程有限公司进行PCR产物测序。

1.2.5 数据统计

1）等位基因频率：按下列公式计算。

式中，Pi为第i个等位基因的频率，i为纯合复等位基因，j1、j2……jn为与i共有的第1到第n个等位基因。

2）基因型频率：基因型频率＝基因型个体数/测定群体总数。

3）多态性分析：多态性信息含量(polymorphism information content,PIC)、观察杂合度（observed heterozygosiy, Ho）、遗传杂合度（heterozygosity,He）和有效等位基因数（efective number ofalleles,Ne）等遗传参数用POPGEN32软件统计分析（Nei Met al，1979；Nei M，et al，1974）。

4）最小二乘法统计分析模型：利用SPSS 13.0软件分析场地和基因型等因素与肉质性状的相关性。根据影响藏羊生长性状的不同因素，采用以下固定模型，同时根据实际情况进行取舍。固定模型如下：

y=μ+Farm+Genetype+X+e

其中：y为个体表型记录；μ为群体平均值；Farm为场际效应；Genetype为标记基因型效应；X为各种二级和二级以上互作效应，如Farm×Genetype等；e为随机误差。用SPSS13.0软件对数据进行分析，并用最小二乘法拟合线性模型，对各基因型间生长性状进行差异显著性分析，分析不同基因型与宰前活重、胴体重、GR值、眼肌面积、系水力、嫩度等性状的相关性。

2 结果与分析

2.1 HRM突变扫描检测

经优化PCR条件后，将用于HRM突变扫描检测的PCR产物1%凝胶电泳和HRM检测。由图1可见，由引物E2F/E2R、E3F/E3R扩增的PCR产物分别为183 bp、258 bp的特异性条单带，无杂带，可进行HRM检测。经HRM检测，E2F/E2R扩增的PCR产物明显地分为3种类型，测序鉴定发现这3种类型分别为CC野生型、GG纯合型和GC杂合型3种基因型（图2）。测序结果显示，在脂联素第2外显子片段出现一处突变，对应于基因组序列（GenBank登录号：NC_007299）+67G>C，此处的突变位于编码区，并引起了氨基酸的改变，使第22位氨基酸的第一位密码子G变为C，氨基酸由原来的谷氨酸改变为谷氨酰胺。在脂联素第3外显子中未发现多态性。

图1 脂联素基因第2、3外显子引物扩增琼脂糖凝胶电泳检测结果

图2 脂联素基因第2外显子+67G>C位点基因分型结果

2.2 群体遗传分析

2.2.1 藏羊脂联素基因第2外显子+67G>C位点遗传分析 对甘肃欧拉型、甘加型、乔科型藏羊脂联素基因第2外显子+67G>C位点遗传分析，G等位基因为优势等位基因，3个群体基因频率分别为0.821、0.860、0.864。GG基因型为优势基因型，3个群体基因型频率分别为0.736、0.737和0.773（表2）。进行Hardy-Weinberg平衡检验，仅欧拉型藏羊在 +67G>C位点上处于Hardy-Weinberg不平衡状态（P<0.05）。进行基因杂合度、有效等位基因数、多态信息含量统计分析，结果如表2所示，可见+67G>C位点在3个群体中均为中度多态，多态信息含量欧拉型藏羊最高，纯合度甘加型藏羊最高，杂合度欧拉型藏羊最高。

表2 脂联素基因第2外显子+67G>C位点在甘肃藏羊中的遗传分析

2.2.2 +67G>C位点不同基因型与甘肃藏羊产肉和肉质性状的关联分析 应用建立的最小二乘法线性模型，对甘肃欧拉型、甘加型、乔科型藏羊脂联素基因第2外显子+67G>C位点的不同基因型与宰前活重、胴体重、GR值、眼肌面积、系水力、嫩度等性状进行方差分析（表3）。由表3可以看出，GG、GC基因型个体的宰前活重、胴体重均值均显著高于CC型个体（P<0.05），GR值、眼肌面积、失水力、剪切力等性状在不同基因型个体之间差异均不显著（P>0.05）。

表3 脂联素基因第2外显子+67G>C位点不同基因型与藏羊产肉和肉质性状的关联分析

3 讨论

脂联素在脂肪代谢中起着重要作用。本研究在脂联素第2、3外显子检测的区域中，仅在第2外显子中检测到一处突变，为错义突变，这与杨彦杰等［10］在秦川牛中的结果一致。Morsci等［12］在编码区也仅检测到一处突变，为同义突变（第59位氨基酸的第3位密码子T>C）。其余突变均在非编码区，而且大部分都在启动子区。Morsci等［12］在安格斯牛的启动子区也检测到了8个突变，张良志等［13］在秦川牛的启动子区也检测到了11个突变。因此，在今后的研究中将重点开展脂联素启动子区多态性研究。

Botstein等提出了衡量基因变异程度高低的多态信息含量指标（PIC）。当PIC>0.5时,该位点为高度多态位点；当0.5>PIC>0.25时,该位点为中度多态位点；当PIC<0.25时,该位点为低度多态位点。本试验对脂联素基因的第2外显子+67G>C位点研究发现,欧拉型藏羊杂合度和多态信息含量最高,说明欧拉型藏羊在本研究中发现的多态处选择的遗传潜力最大。本研究结果表明，脂联素基因在不同的品种中具有丰富的多态性,这为进一步分析其与脂肪等性状的关系,进而确定能否用于甘肃藏羊的脂肪沉积的选择标记奠定了基础。

Dai等［14］在猪的外显子2中发现一处错义突变A/G（第59位的缬氨酸被替换为异亮氨酸），在内含子2中也发现了一处突变（第298位A/G），并通过关联分析发现这两处突变与猪的部分脂肪沉积性状和胴体性状（背膘厚，眼肌面积，瘦肉率，骨的比例，平均脂肪量，肩部背膘厚等）有关联。杨彦杰等［10］在脂联素基因第2外显子64 bp处和第3外显子50 bp处发现的两处突变都发生在编码区,并且导致氨基酸发生改变。在对这两个位点突变与胴体及肉质关联性分析的结果表明：脂联素基因与秦川牛胸围、眼肌面积、背膘厚、胴体腿臀围方面密切相关。本研究进一步将脂联素基因第2外显子+67G>C位点不同基因型与甘肃藏羊产肉和肉质性状的关联分析表明，GG、GC基因型个体的宰前活重、胴体重均显著高于CC型个体（P<0.05），这与杨彦杰等［10］在秦川牛中的研究结果一致。因此，初步推测脂联素基因第2外显子+67G>C位点可能是控制甘肃藏羊宰前活重和胴体重的一个主效基因或是与之存在紧密遗传连锁的分子标记，但由于本研究的样本数量较少，因此有必要进行更大样本量或对其他品种进行分析验证。

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SNPs of Adiponectin Gene and Its Relationship with Meat Traits in Tibetan Sheep

YangShu-meng，Ma Deng-lu，GuoShu-zhen，et al
（Gannan Institute ofAnimal Sciences，Hezuo747000，Gansu，China）

Gansu Tibetan sheep（Euler type，Ganga type，Choco type）（n=176）were used to detect SNPs of adiponectin gene by high-resolution melting（HRM）analysis and toanalyze the correlation ofSNPs with carcass and meat traits usingthe general linear model（GLM）.There was onlyone single nucleotide polymorphism（SNP）identified as SNP+67G>Cin exon2 ofadiponectin，results in a missense mutation from Glu to Gln.Statistical analysis revealed that Tibetan sheep with GG，GC genotype was higher than CC genotype in slaughter weight，carcass weight（P<0.05）.Adiponectin gene was proved to be closely related to carcass and meat traits，which could be used as a candidate molecular marker for production ofhigh-grade meat in Tibetan sheep.

adiponectin gene；SNPs；meat traits；Tibetan sheep

S826.2

A

2095-3887（2014）02-0005-05

10.3969/j.issn.2095-3887.2014.02.001

2013-11-27

杨树猛（1976-），男，高级畜牧师。

马登录（1970-），男，高级畜牧师。