王凤军，张祥林，谭志文，马海波，冯俊丽，王鹏举（.库尔勒出入境检验检疫局，新疆库尔勒8000；.新疆出入境检验检疫局，新疆乌鲁木齐80000；.浙江万里学院，浙江宁波00；.新疆农业大学，新疆乌鲁木齐80000；.浙江理工大学生物工程研究所，浙江杭州008）

枣褐斑病菌实时荧光PCR快速检测方法研究

王凤军1，张祥林2，谭志文3，马海波4，冯俊丽5，王鹏举1
（1.库尔勒出入境检验检疫局，新疆库尔勒841000；2.新疆出入境检验检疫局，新疆乌鲁木齐830000；3.浙江万里学院，浙江宁波315100；4.新疆农业大学，新疆乌鲁木齐830000；5.浙江理工大学生物工程研究所，浙江杭州310018）

根据枣褐斑病原菌链格孢子基因组保守序列，设计特异性引物和双荧光标记探针，建立了枣褐斑病菌的TaqMan实时荧光PCR检测方法。此外，还对其他2种红枣植物病害病原菌和6种链格孢菌种进行了荧光PCR检测。结果表明，只有枣褐斑病菌产生荧光信号，其他病原菌均没有荧光信号产生。与常规PCR相比，TaqMan实时荧光PCR检测特异性强，灵敏度高，能检测到浓度为1.4pg/μL的DNA样本。该方法全程不必通过病原菌的分离与纯化培养，可直接用于病变样品的检测以及枣褐斑病的筛查与动态监测，适合枣褐斑病的快速诊断和分子监测。

枣，链格孢菌，实时荧光PCR，快速检测

枣褐斑病主要侵害果实，引起果实腐烂和提早脱落，是枣区一种严重的果实病害。近十几年来，该病的发生日趋严重，流行年份病果率高达50%左右，严重者可达70%以上，甚至绝收，给红枣的产量和品质造成了很大影响[1]。2012年新疆巴州地区降雨量明显增加，相对湿度较高，枣园通风不畅，部分枣区褐斑病大量蔓延。最近有报道指出这是由链格孢菌（Alternaria alternate）引起的储藏期病害[2]。

链格孢菌为半知菌亚门丝孢纲丝孢目链格孢属真菌，寄主范围广，在苹果、梨、甘薯、柑橘、番茄、鸭梨、非洲菊、苜蓿等蔬果上均有报道[3-8]。目前，对链格孢菌等植物病原真菌的分类鉴定主要通过分离培养与显微观察等，受到培养条件等因素的影响，且耗时长，对鉴定工作带来很大困难[6]。

随着分子生物学不断发展，PCR技术已广泛用于植物病害检测。该方法主要对在科、属、种水平上高度特异的rDNA的ITS区段进行PCR扩增，测序分析后设计特异性引物来检测植物病原菌。在此方法基础上，又逐渐发展了RT-PCR、巢式RT-PCR、免疫捕获反转录PCR等[9-12]，有效遏制了国外有害生物入侵，保证生物入境安全。但这些方法需进一步分子杂交或克隆测序鉴定，仍需要较长的检测时间，难以满足快速诊断的需要。

实时荧光PCR把荧光共振能量转移与荧光标记探针相结合，将核酸扩增和光谱分析融合在一起，使用荧光监测系统对整个扩增过程进行实时监控，具有操作简单，检测迅速，准确灵敏等特点，已广泛应用于植物病原菌的检测与鉴定[13-14]。本研究通过设计特异性引物和探针建立的基于TaqMan探针的实时荧光PCR检测技术可对枣褐斑病的诊断和快速检测提供技术保障。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

所用的菌株 本实验室分离保存，感病红枣果实或疑似褐斑病的红枣样本以及阴性对照样本采自新疆巴州若羌县枣园；供试菌株 主要购自中国微生物菌种中心，部分菌种由河北出入境检验检疫局技术中心惠赠（表1）；基因组DNA提取试剂盒 天根生化科技（北京）有限公司；荧光定量PCR检测试剂盒 宝生物工程（大连）有限公司；探针与引物 委托美国Invitrogen公司合成。

ABI7500型实时荧光定量PCR仪 美国应用生物系统公司；ND2000C型核酸蛋白分析仪 美国热电公司；1-14ED小型离心机 德国Sigma公司。

1.2 实验方法

1.2.1 分离培养与纯化 对感病红枣样本先用75%酒精脱脂棉擦拭果实表面，用灭菌的解剖刀切取萼端、胴部和梗端，0.25%次氯酸钠表面消毒1min，用无菌水清洗2～3次，移至PCA平板（马铃薯20g，胡萝卜10g，琼脂18g，蒸馏水1000mL）上，25℃黑暗培养5～ 7d，待长出菌落后进行纯化鉴定。

1.2.2 基因组DNA的提取 称取红枣病变部位样品100mg，按照基因组DNA提取试剂盒说明书进行操作，加入50滋L灭菌ddH2O洗脱两次。用核酸蛋白分析仪检测DNA提取的纯度和浓度。

1.2.3 引物和探针设计 根据NCBI的Genbank核酸序列数据库中真菌核糖体18S rDNA基因序列中表达链格孢菌基因片段（JN392101.1），使用Primer Express 3.0软件设计引物和探针，确定引物Tm值在55～57℃之间，在DNAstar软件上评价引物的特异性，在BLAST网页上比对扩增产物的特异性。

1.2.4 实时荧光定量反应 反应体系（25滋L）含10× PCR Buffer 2.5滋L，dNTP（400滋mol/L）2滋L，引物（10滋mol/L）0.5滋L，探针（10滋mol/L）0.5滋L，500U Taq DNA聚合酶0.25滋L，DNA模板3滋L，ddH2O 15.75滋L。反应参数设置为：95℃预变性3min；95℃变性30s，58℃退火/延伸1min，共计40个循环。

1.2.5 建立标准曲线 将测定好浓度的枣褐斑病基因组DNA作为标准品，进行10倍梯度稀释，共设置5个梯度，分别为14.0000、1.4000、0.1400、0.0140和0.0014ng/滋L，稀释介质为灭菌ddH2O。对5个梯度的标准品进行实时荧光定量反应，每个梯度设置3个重复。

2 结果与分析

2.1 枣褐斑病菌的形态学鉴定

对采集的感病枣果样本进行病原菌的分离培养与纯化鉴定，共分离28个枣，140个组织块，其中25个病果，70个组织块中经纯化培养（图1A）和显微观察（图1B）确认为枣褐斑病链格孢属[15]。

表1 供试菌株及其来源Table 1 Sources of Alternaria isolates tested

2.2 引物和探针特异性检测

本实验根据于占晶等[2]使用的链格孢菌专有化引物Aalt-F/Aalt-R序列，在BLAST网页上进行Primer-Blast比对，寻找到链格孢菌在真菌核糖体18S rDNA基因序列特异性片段并在此片段上设计上游和下游引物及Taqman探针，探针5’端以FAM作荧光标记，3’端以TAMRA作标记。引物和探针序列见表2。

表2 红枣褐斑病病原菌基因引物和探针序列Table 2 The primers and probe of the gene of pathogen causing brown spot on jujube

以红枣裂果病和红枣缩果病病变组织样品及表1中的6种菌种提取的DNA为模板进行实时荧光定量PCR，验证红枣褐斑病病原菌基因引物和探针的特异性。结果显示，只有以红枣褐斑病DNA为模板的反应管中显示了指数型扩增曲线，其他红枣病害样本均无信号（图1），证明红枣褐斑病病原菌基因引物和探针在红枣病害的鉴定中具有特异性。

图2 红枣褐斑病病原菌基因引物和探针特异性检测Fig.2 Detection results of the gene of pathogen causing brown spot on jujube

2.3 重复性和灵敏性检测

分别以5个浓度梯度的枣褐斑病菌标准品为模板进行实时荧光定量反应，以标准品浓度的自然对数值为横坐标，以Ct值为纵坐标做标准曲线（图2），其R2为0.992。对Ct值统计分析（表3），同一参照样品重复间Ct值变异较小，链格孢菌基因Ct值变化范围在24.60～37.04之间，标准偏差在0.033～0.146之间，表明该方法具有较好的重复性和稳定性。

如表3所示，在最高稀释度的样品中，枣褐斑病链格孢菌基因得到扩增，Ct值为36.94，大于检测临界限（Ct=35），结果表明，枣褐斑病链格孢菌基因在模板浓度为0.0140ng/滋L时为有效扩增，即确定该浓度为最低定量限，最低检测限为0.0014ng/滋L，即1.4pg/滋L。

表3 红枣褐斑病DNA标准品Ct值分析表Table 3 Ct value analysis of DNA samples of pathogen causing brown spot on jujube

图3 枣褐斑病链格孢菌基因扩增曲线及标准曲线Fig.3 The amplification plot and standard curve of the pathogen gene causing brown spot on jujube

3 结论

枣树易感黑斑病、枣锈病、枣缩果病、枣裂果病和炭疽病等严重植物病害，其中大多为真菌病害[2，16]，严重影响枣的品质和产量。本研究对采集的28个病果的140个组织块进行分离培养，在70个组织块中分离出菌落形态较为一致的菌株。通过病菌形态特征观察和鉴定及实时荧光PCR扩增，将感病枣果的病原菌确定为A.alternata。孙恩等对广东省观赏性植物银海枣褐斑病进行分离培养，病原鉴定为链格孢A.alternata[17]。王军等用常规方法分离冬枣黑斑病病原，获得3种真菌，通过回接健康果实，经形态学鉴定，初步确定致病菌为A.alternata[18]。于占晶等对壶瓶枣褐斑病进行分离培养，形态观察，rDNA ITS序列分析以及特异性引物扩增，确定病原菌为A.alternata[2]。本文的研究结果与已报告的结果一致，明确了若羌红枣褐斑病病原菌为A.alternata。

本研究基于TaqMan实时荧光定量PCR技术建立快速检测枣褐斑病菌方法。通过对梯度稀释的标准品实时荧光反应建立标准曲线，相关系数R2为0.992，确定最低检测限为1.4pg/滋L，结果表明该方法特异性好，荧光信号强，灵敏度高，减少了交叉污染，可实现枣褐斑病的分子鉴定、早期诊断和快速检测，为更好的控制枣褐斑病病害蔓延和提高农业经济效益提供技术保障。

[1]康卫华，秦新建，闻宁丽，等.枣果常见病害症状鉴别及防治技术[J].宁夏农林科技，2011，7（2）：34.

[2]于占晶，侯晓杰，崔建州，等.壶瓶枣褐斑病病原菌的鉴定[J].植物病理学报，2010，40（1）：7-13.

[3]李永才，毕阳.苹果梨黑斑病的发生及侵染过程[J].植物保护学报，2006，33（2）：131-135.

[4]OBA K，OGA K，URITANI I.Metabolism of ipomeamarone in sweet potato root slices before and after treatment with mercuric chlorideorinfectionwithCeratocystisfimbritata[J].Phytochemistry，1982，21（8）：1921-1925.

[5]PRUSKY D，FUCHS Y，YANKO U.Assessment of latent infections as a basis for control of postharvest disease of mango [J].Plant Disease，1983，67（7）：816-818.

[6]张志铭，宋福，孙淑贞，等.河北鸭梨黑斑病病原菌的鉴定[J].植物检疫，2003，17（4）：212-214.

[7]刘芳，高原，张竞颐，等.北京地区非洲菊叶斑病病原菌鉴定[J].菌物学报，2010，29（1）：22-25.

[8]王婷，王生荣.甘肃苜蓿斑点病的初步研究[J].草地学报，2010，18（3）：372-377.

[9]Spiegel S，Scott SW，Bowman-Vance V.Improved detection of prunus necrotic ring spot virus by the polymerase chain reaction[J].Eur J Plant Pathol，1996，102（7）：681-685.

[10]Rosner A，Malesnin L，Spiegel S.The use of short and long PCR products for improved detection of prunus necrotic ringspot virus in woody plants[J].J Virol Methods，1997，67（2）：135-141.

[11]Kölber M，Németh M，Krizbai L.Detectability of Prunus necrotic ringspot and plurn pox viruses by RT-PCR，multiPlex RT-PCR，ELISA and indexing on woody indicators[J].Acta Horticulturae，1998，472：243-248.

[12]Helguera P R，Taborda R，Docampo DM.Immunocapture reverse transcription polymerase chain reaction combined with nested PCR greatly increases the detection of Prunus necrotic ringspot virus in the peach[J].J Virol Methods，2001，95（1/2）：93-100.

[13]郑静，张震，姜华，等.稻曲病菌分生孢子实时PCR定量检测方法的建立及初步应用[J].中国水稻科学，2012，26（4）：500-505.

[14]朱建裕，黄秋霞，高必达.建立基于TaqMan探针的李坏死环斑病毒实时荧光RT-PCR检测方法[J].微生物学通报，2011，38（8）：1295-1299.

[15]张天宇.中国真菌志[M].北京：科学出版社，16：1-283.

[16]况红玲.中国部分枣产区枣主要果实病害的病原及药剂筛选[D].北京：北京林业大学，2007.

[17]孙恩，王军.银海枣褐斑病的病原鉴定与化学防治[J].华南农业大学学报，2006，27（3）：221-228.

[18]王军，辛玉成.冬枣黑斑病病原的分离与鉴定[J].青岛农业大学：自然科学版，2007，24（1）：21-23.

Real-time fluorescence PCR method for detection of the pathogen causing brown spot on jujube

WANG Feng-jun1，ZHANG Xiang-lin2，TAN Zhi-wen3，MA Hai-bo4，FENG Jun-li5，WANG Peng-ju1
（1.Korla Entry-Exit Inspection and Quarantine Bureau，Korla 841000，China；2.Xinjiang Entry-Exit Inspection and Quarantine Bureau，Urumqi 830000，China；3.Zhejiang Wanli University，Ningbo 315100，China；4.Xinjiang Agricultural University，Urumqi 830000，China；5.Institute of Bioengineering，Zhejiang Sci-Tech University，Hangzhou 310018，China）

A real-time fluorescence PCR method was established by using a pair of specific primers and doublefluorescence labeling probe according to the conserved sequence of the total nucleic acid extracted from the diseased jujubes causing brown spot.The real-time fluorescence PCR was used to detect other two kinds of plant disease pathogens on jujubes and six standard strains of Alternaria alternaria purchased by general microbiological culture collection center.The results showed that fluorescence signal could be collected with the combination of the specific primers and probe only in the pathogen causing brown spot on jujubes.The assay for specific detection was more sensitive than conventional PCR，which could detect the limit concentration of diseased samples as low as 1.4pg/μL analyzed by the standard curve in this method and have no need of culture，conventional identification and microscopic examination of the pathogens with the traditional method of biology.This reliable，sensitive，quick and easy-handling method could reach the species level and suitable for screening，dynamic monitoring and identification of plant diseases.

jujubes；Alternaria alternate；real-time fluorescence PCR；rapid detection

TS207.3

A

1002-0306（2014）14-0056-04

10.13386/j.issn1002-0306.2014.14.002

2013－09－28

王凤军（1984-），女，硕士研究生，工程师，主要从事植物病害和转基因检测方面的研究。

国家质量监督检验检疫总局资助项目（201110022-3）；国家质量监督检验检疫总局资助项目（2012IK290）；库尔勒市重点科技项目。