邱玲玲，胡中扬，杨锡荣，王 倩，刘 佳，宋 治

原发性高血压病是遗传易患性与环境因素共同作用导致的慢性复杂疾病，是心脑血管疾病的独立危险因素。全球原发性高血压病患病率呈上升趋势，据统计，2000年有26.4%的成人患有高血压，预计到2025年总患病率将达到29.2%［1］。超重及肥胖是原发性高血压病的危险因素已得到广泛认知，但目前国内外对与肥胖有关的基因与原发性高血压病的相关性研究较少。位于黑素皮质素受体 －4基因 (melanocortin－4 receptor gene，MC4R)附近的单核苷酸多态性 (SNP)位点rs17782313是全基因组关联分析 (genome wide association study，GWAS)发现的肥胖相关基因位点。Loos等［2］通过对16 876例大样本的荟萃分析发现该位点与体质量呈正相关。我国学者在对3 077例年龄在6～18岁的样本研究中发现肥胖易感位点如脂肪量和肥胖相关基因 (fat mass and associated gene，FTO)与高血压相关，但尚未发现MC4R rs17782313位点多态性与高血压的关系。有研究认为该位点与导致高血压发病的危险因素相关［3］。本研究旨在通过检测湖南长沙地区汉族人群与肥胖相关的rs17782313位点多态性，进而从遗传学角度探讨该位点与长沙地区汉族人群原发性高血压病的相关性。

1 对象与方法

1.1 研究对象 2011年6月—2012年7月选取在中南大学湘雅三医院住院的原发性高血压病患者及体检中心体检健康者共768例，分为高血压组 (440例)和对照组 (328例)。高血压组患者间彼此无亲缘关系，其中男258例、女182例;平均年龄 (63.2±10.5)岁;均符合1999年世界卫生组织/国际高血压协会诊断标准［4］:未服降压药的情况下收缩压≥140 mm Hg(1 mm Hg=0.133 kPa)和/或舒张压≥90 mm Hg或已确诊为高血压并服用降压药。排除继发性高血压、慢性肝肾功能不全、恶性肿瘤、先天性心脏病、风湿性心脏病患者。对照组为无亲缘关系的健康个体，其中男193例、女135例;平均年龄 (61.4±10.2)岁。高血压组和对照组均为长沙地区汉族人群，并签署知情同意书。

1.2 研究方法

1.2.1 临床资料及标本采集 收集一般临床资料〔性别、年龄、体质量、体质指数 (BMI)、收缩压(SBP)、舒张压 (DBP)、总胆固醇 (TC)、低密度脂蛋白胆固醇 (LDL－C)、高密度脂蛋白胆固醇(HDL－C)、三酰甘油 (TG)、尿酸 (UA)、空腹血糖(FBG)〕。受试者禁食12～14 h后，抽取肘静脉血约5 ml，加入到乙二胺四乙酸二钾 (EDTA－K2)抗凝试管中，置于－20℃冰箱中储存待用。

1.2.2 基因组DNA提取 取储存的肘静脉血300 μl经红细胞裂解液裂解后严格按DNA提取试剂盒 (北京鼎国昌盛生物技术公司)说明书提取基因组DNA，并置于－20℃冰箱保存。

1.2.3 引物设计和合成 聚合酶链反应 (PCR)和单碱基延伸反应引物均由AssayDesigner 3.1软件包设计，由大连宝生物工程有限公司合成。rs17782313 PCR上游引物为:ACGTTGGATGCTTAAATGTCACCTTCCCCC，下游引物为:ACGTTGGATGAGAAGTTTAAAGCAGGAGAG，单碱基延伸反应引物为:AGCTTTTCTTGTCATTTCCATC。

1.2.4 基因多态性检测 采用PCR及飞行时间质谱技术 (MALDI－TOF－MS)对rs17782313位点进行检测。PCR及MALDI－TOF－MS主要步骤如下:(1)PCR扩增反应:①PCR反应体系为基因组DNA 10 ng，引物0.1 μmol，4 × dNTP 500 μmol，Taq 酶 1 Unit，10 × Taq酶缓冲液0.5 μl，MgCl21.625 mmol。②扩增条件为94℃预变性15 min;94℃变性20 s，56℃退火30 s，72℃延伸60 s，进行45次循环，最后72℃延伸3 min;4℃保存。(2)虾碱性磷酸酶 (shrimp alkaline phosphatase，SAP)反应:碱性磷酸酶消化PCR扩增后剩余的dNTP及残留引物。(3)单碱基延伸反应:①反应体系为生化分析型超纯水0.619 μl，特异性终止反应物0.2 μl，延伸 反 应 引 物 0.94 μl，iPLEX 缓 冲 液 0.2 μl，iPLEX酶0.041 μl及经纯化后的PCR反应产物7 μl，总体积9 μl。②反应条件为94℃预变性30 s;94℃变性5 s，52℃退火5 s，80℃延伸5 s，共进行40次循环，其中52℃退火5 s及80℃延伸5 s进行5次循环，最后72℃延伸3 min;4℃保存。(4)去盐及上机检测:将上一步的反应产物加入阳离子交换树脂完成去盐，将产物点样后利用质谱仪进行分析，并使用Mass ARRAY Typer软件分析基因分型数据。

1.3 统计学方法 采用SPSS 17.0软件进行统计处理，计量资料以 ()表示，采用t检验;计数资料采用χ2检验;数量性状 (QTL)位点分析采用单因素线性回归分析;高血压的危险因素采用多因素Logistic回归分析。以P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 高血压组和对照组临床资料比较 两组的年龄、体质量、BMI、SBP、DBP、TC、LDL－C、TG、UA、FBG比较，差异有统计学意义 (P＜0.05);两组的性别构成、HDL－C比较，差异无统计学意义 (P＞0.05，见表1)。

表1 两组临床资料比较Table 1 Comparison of clinical data between the two groups

2.2 rs17782313位点基因型分布及等位基因频率比较

经PCR及MALDI－TOF－MS技术能检测到基因型的样本高血压组为435例，对照组为321例，得到rs17782313位点基因型为 CT、CC、TT(见图1～3)。高血压组和对照组的基因分布频率均符合Hardy－Weinberg平衡检验(χ2=0.928、1.464，P=0.335、0.226)，说明本实验所选择的样本具有群体代表性。高血压组和对照组基因型分布和等位基因频率比较，差异均有统计学意义 (P＜0.05，见表2)。

图1 rs17782313位点 CT基因型 MALDI－TOF－MS质谱图Figure 1 Diagram of MALDI－TOF－MS for genotype CT of rs17782313

图2 rs17782313位点 CC基因型MALDI－TOF－MS质谱图Figure 2 Diagram of MALDI－TOF－MS for genotype CC of rs17782313

2.3 QTL位点单因素线性回归分析 以MC4R基因rs17782313位点为自变量，将表1各代谢指标依次作为因变量，分析各代谢指标与rs17782313位点是否存在线性回归关系，结果发现仅TC与rs17782313位点存在线性回归关系，差异有统计学意义 (r=0.08，β=0.101，P=0.032)。

2.4 高血压影响因素的多因素Logistic回归分析 以有无高血压作为因变量，以性别、超重和肥胖、高脂血症(分别为高三酰甘油血症、高胆固醇血症、高低密度脂蛋白血症)、C等位基因作为自变量进行Logistic回归分析，结果发现超重和肥胖、高三酰甘油血症、C等位基因是原发性高血压病的独立危险因素 (P＜0.05，见表3)。

图3 rs17782313位点 TT基因型MALDI－TOF－MS质谱图Figure 3 Diagram of MALDI－TOF－MS for genotype TT of rs17782313

表2 两组基因型和等位基因频率比较〔n(%)〕Table 2 Comparison of distribution of geneotypes and allele frequencies between the two groups

表3 高血压影响因素的多因素Logistic回归分析Table 3 Multivariate Logistic regression analysis on influencing factors for hypertension

3 讨论

原发性高血压病是多个微效基因遗传与环境因素相互作用的复杂疾病。超重和肥胖是原发性高血压病的独立危险因素在国内外早已形成共识，腰臀比 (WHR)、BMI、腰围 (WC)可预测高血压的发生风险［5］。近来研究表明，遗传因素在原发性高血压病的发生、发展中起重要作用［6］。超重和肥胖本身引起的代谢紊乱与动脉硬化存在密切关系，且脂肪组织分泌的脂肪因子如瘦素与高血压相关［7－8］，因此与超重和肥胖相关的基因有可能是引起原发性高血压病的候选基因。

MC4R是Willer等［9］研究发现的与 BMI、肥胖呈强阳性相关的基因，是能量平衡及饮食摄入的重要调节因子。rs17782313位点位于MC4R下游188 kb处18q22上。本研究发现，高血压组CC、CT、TT基因型分布与对照组有明显差异，且高血压组C等位基因频率高于对照组;此外，多因素Logistic回归分析发现，C等位基因是高血压的独立危险因素〔OR(95%CI)=1.444(1.040，2.006)，P=0.028〕，提示rs17782313位点携带C等位基因者患高血压的风险是非C等位基因携带者的1.444倍。以上说明rs17782313位点多态性是湖南地区汉族人群高血压高发的重要遗传危险因素。对于该基因与原发性高血压病直接相关还是通过肥胖再导致高血压的发生目前尚无定论。

Timpson等［10］对丹麦白色人种54 244例样本研究发现，MC4R rs17782313位点多态性与BMI相关，而与高血压无直接相关性，每增加10%BMI即可增加3.85 mm Hg SBP和1.79 mm Hg DBP，认为rs17782313位点可能通过BMI这个中间表型间接与高血压有关。另外，在对我国6～18岁大样本的研究中也发现，调整BMI后rs17782313位点与高血压发病风险的相关性消失，提示该位点可能通过BMI间接与高血压的易患风险有关［3］。与之相反，本研究结果显示，rs17782313位点与高血压发病直接相关，有可能是由于选择的研究对象不同造成与上述研究结果不一致。有关学者倾向于认为MC4R与高血压的发生有着直接相关关系，并就其可能的内在病理生理机制作了研究。Greenfield等［11］从遗传学及药理学角度说明MC4R与高血压有关，并且通过中枢性黑素皮质信号通路影响高血压的发生，这种作用的实现与肥胖所致的高胰岛素血症无关。Sohn等［12］认为MC4R产物黑素皮质素受体－4具有双向调节交感神经及副交感神经节前神经元的作用，从而影响胰岛素及血压的变化。

在对我国汉族儿童人群的研究中也发现rs17782313位点与中心性肥胖相关［13］。Dwivedi等［14］研究发现rs17782313位点在儿童及成年人中均与肥胖相关，但其相关性随着年龄的增加而减弱。本研究尚未发现rs17782313位点与BMI或肥胖存在线性回归关系，与以上结论不一致，但与Vasan等［15］的研究结果一致。可能与以下因素有关:(1)与研究对象的选择有关，本研究的研究对象平均年龄＞60岁，属于老年人群，随着年龄的增加，容易出现骨质疏松、脊柱变形，因此所测身高与体质量可能存在一定偏差，从而对以BMI为指标界定的肥胖可能造成一定影响;此外，rs17782313位点本身可能与年龄存在相关性，因为随着年龄的增加环境因素可能会掩盖或减弱微效基因作用［14］。(2)不同地区、不同人群的背景存在差异性。(3)可能与本研究的样本量，所选择的统计学方法有关。本研究结果显示，rs17782313位点与TC存在线性回归关系，但未发现与LDL－C相关，与有关学者发现该位点与TC及LDL－C均相关不同［16］。Cheung等［17］认为 rs17782313 位点与代谢综合征有相关性。Wilkinson等［18］发现高胆固醇血症患者与对照组相比有更高的中心脉压及更严重的动脉硬化程度。综合以上文献信息，提示rs17782313位点有可能通过血清TC的变化导致动脉硬化、血管重构，从而间接引起高血压。

综上所述，本研究提示rs17782313位点多态性与湖南长沙地区汉族人群原发性高血压病相关，从遗传流行病学角度认为该位点携带C等位基因者存在遗传易患性，但是原发性高血压病是多基因遗传与多环境因素共同作用的慢性疾病，故高血压发病仍存在环境等因素的作用。由于本研究样本量较小，结果可能存在一定的局限性。因此，今后应在扩大样本量的基础上进一步针对强微效基因之间或微效基因与环境因素之间交互作用进行研究，以进一步明确原发性高血压病的发病机制。

1 Kearney PM，Whelton M，Reynolds K，et al.Global burden of hypertension:analysis of worldwide data ［J］. Lancet， 2005，365(9455):217－223.

2 Loos RJ，Lindgren CM，Li S，et al.Common variants near MC4R are associated with fat mass，weight and risk of obesity ［J］.Nat Genet，2008，40(6):768－775.

3 Xi B，Zhao X，Shen Y，et al.Associations of obesity susceptibility loci with hypertension in Chinese children［J］.Int J Obes(Lond)，2013，37(7):926－930.

4 中国高血压防治指南起草委员会.中国高血压防治指南［J］.高血压杂志，2000，8(1):99.

5 Feldstein CA，Akopian M，Olivieri AO，et al.A comparison of body mass index and waist－to－hip ratio as indicators of hypertension risk in an urban Argentine population:a hospital－ based study［J］.Nutr Metab Cardiovasc Dis，2005，15(4):310 －315.

6 Yamamoto H，Okuzaki D，Yamanishi K，et al.Genetic analysis of genes causing hypertension and stroke in spontaneously hypertensive rats［J］.Int J Mol Med，2013，31(5):1057 －1065.

7 Segal－Lieberman G，Rosenthal T.Animal models in obesity and hypertension［J］.Curr Hypertens Rep，2013，15(3):190 －195.

8 Allison MA，Ix JH，Morgan C，et al.Higher leptin is associated with hypertension:the Multi－Ethnic Study of Atherosclerosis［J］.J Hum Hypertens，2013，27(10):617 －622.

9 Willer CJ，Speliotes EK，Loos RJ，et al.Six new loci associated with body mass index highlight a neuronal influence on body weight regulation［J］.Nat Genet，2009，41(1):25 －34.

10 Timpson NJ，Harbord R，Davey Smith G，et al.Does greater adiposity increase blood pressure and hypertension risk?Mendelian randomization using the FTO/MC4R genotype［J］.Hypertension，2009，54(1):84－90.

11 Greenfield JR，Miller JW，Keogh JM，et al.Modulation of blood pressure by central melanocortinergic pathways［J］.N Engl J Med，2009，360(1):44－52.

12 Sohn JW，Harris LE，Berglund ED，et al.Melanocortin 4 receptors reciprocally regulate sympathetic and parasympathetic preganglionic neurons［J］.Cell，2013，152(3):612 －619.

13 Xi B，Cheng H，Shen Y，et al.Study of 11 BMI－associated loci identified in GWAS for associations with central obesity in the Chinese children［J］.PLoS One，2013，8(2):e56472.

14 Dwivedi OP，Tabassum R，Chauhan G，et al.Strong influence of variants near MC4R on adiposity in children and adults:a cross－sectional study in Indian population［J］.J Hum Genet，2013，58(1):27－32.

15 Vasan SK，Fall T，Neville MJ，et al.Associations of variants in FTO and near MC4R with obesity traits in South Asian Indians［J］.Obesity(Silver Spring)，2012，20(11):2268－2277.

16 Tao L，Zhang Z，Chen Z，et al.A Common variant near the melanocortin 4 receptor is associated with low－density lipoprotein cholesterol and total cholesterol in the Chinese Han population［J］.Mol Biol Rep，2012，39(6):6487 －6493.

17 Cheung CY，Tso AW，Cheung BM，et al.Genetic variants associated with persistent central obesity and the metabolic syndrome in a 12－year longitudinal study［J］.Eur J Endocrinol，2011，164(3):381－388.

18 Wilkinson IB，Prasad K，Hall IR，et al.Increased central pulse pressure and augmentation index in subjects with hypercholesterolemia［J］.J Am Coll Cardiol，2002，39(6):1005 －1011.