王 丽 仪登霞 杨丽梅* 刘建萍 方智远 程 斐 刘玉梅 庄 木 张扬勇 孙培田

（1 青岛农业大学园艺学院，山东青岛 266109；2 中国农业科学院蔬菜花卉研究所，北京 100081）

结球甘蓝（Brassica oleraceaL.var.capitataL.）是我国重要的蔬菜作物，在蔬菜周年供应及出口贸易中占有重要的地位，种植面积逐年扩大，已达到每年约90万hm2（方智远，2008；杨丽梅 等，2011）。近年来，甘蓝虫害日趋严重，以鳞翅目的小菜蛾（Plutella xylostella）和菜青虫（Pieris rapae）等为害最为严重。尤其是小菜蛾，由于其适应性强、繁殖速度快、世代交替严重、易产生抗药性，已成为甘蓝上最难防治的害虫之一。目前生产上害虫的防治以施用化学药剂为主，但化学农药污染环境、危害人畜健康，且一些害虫已对多种化学杀虫剂产生抗药性。因此，培育抗虫品种是防治害虫最理想的方法。利用植物基因工程技术将外源抗虫基因导入甘蓝，可为甘蓝育种提供有效的抗虫种质资源。

Holbrook 和Miki（1985）首先对甘蓝进行了遗传转化，并获得再生植株；其后许多研究者致力于甘蓝的抗虫转基因研究，并取得了显著成绩（Metz et al.，1995；毛慧珠 等，1996；Jin et al.，2000；李汉霞 等，2006；李贤 等，2008；崔磊 等，2009；Rafat et al.，2010；Yi et al.，2011，2013）。其中研究和应用较多的抗虫基因是Btcry1类基因。cry1Ia8基因是经密码子优化人工合成新序列的cry1类基因，其表达的毒蛋白对小菜蛾等害虫具有高毒力，且与Cry1A类蛋白没有交互抗性（Escudero et al.，2006；窦黎明 等，2007）。

由于春甘蓝生长后期和秋甘蓝苗期处于高温阶段，更有利于小菜蛾的生长发育，因此小菜蛾的发生和为害最严重。中国农业科学院蔬菜花卉研究所甘蓝青花菜课题组之前已获得中晚熟扁球型秋甘蓝Bt 抗虫转基因株系（崔磊 等，2009），但尚缺乏早熟春甘蓝抗虫材料。另外，前人进行遗传转化研究所用的甘蓝材料多为杂交种，限制了其利用。本试验将cry1Ia8基因转入早熟春甘蓝高代自交系F2011 中，获得抗虫转基因植株，进一步丰富甘蓝抗虫种质资源，为甘蓝抗虫育种奠定基础。

1 材料与方法

1.1 试验材料

1.1.1 植物材料 试验于2012年5月至2014年3月在中国农业科学院蔬菜花卉研究所甘蓝青花菜实验室进行。遗传转化材料为早熟圆球型春甘蓝高代自交系F2011，由中国农业科学院蔬菜花卉研究所甘蓝青花菜课题组提供。

1.1.2 抗虫基因 遗传转化所用抗虫基因为Btcry1Ia8基因，由中国农业科学院植物保护研究所提供。

1.1.3 菌株和载体 供试根癌农杆菌菌株为EHA105，质粒载体为pCSIaN（13 kb），含有卡那霉素抗性基因，由中国农业科学院生物技术研究所提供。1.1.4 供试昆虫 生物测定所使用的小菜蛾为敏感小菜蛾种群和对Cry1Ac 有抗性的小菜蛾种群，由中国农业科学院蔬菜花卉研究所昆虫组提供。

1.2 转化所用培养基

MS 培养基为基本培养基，固体YEP 培养基（10 g·L-1酵母提取物+10 g·L-1胰蛋白胨+5 g·L-1NaCl）为培养农杆菌所用培养基，液体MS 培养基为菌液悬浮培养基。甘蓝遗传转化各阶段所用培养基如表1所示。

表1 甘蓝遗传转化所用培养基

1.3 试验方法

1.3.1 结球甘蓝的遗传转化 外植体准备：甘蓝种子经70%酒精灭菌1～2 min，14%次氯酸钠溶液灭菌10 min，无菌水冲洗3～4次后，接种到MS 固体培养基上，25℃、16 h/8 h（昼/夜，下同）光周期条件下进行培养。5 d后，切取无菌苗的下胚轴和具柄子叶作为外植体，接种到预培养培养基上，25℃、16 h/8 h 光周期条件下预培养2 d。

菌液制备：取划线培养的农杆菌单菌落，接种到含100 mg·L-1卡那霉素（Kan）和50 mg·L-1利福平的YEP 液体培养基中，28℃、200 r·min-1条件下振荡过夜。取摇好的菌液（OD600=0.6～0.8），于3 000 r·min-1、4℃条件下离心10 min，收集细菌，用液体MS 培养基悬浮。

遗传转化：取预培养2 d 的下胚轴和具柄子叶，用悬浮好的菌液分别侵染8、15 min。接种到置有一层无菌滤纸的再生培养基上，（25±1）℃条件下暗培养3 d。清洗外植体，接种到延迟培养基上，25℃、16 h/8 h 光周期条件下进行培养。7 d后，将外植体转移到选择培养基上，经卡那霉素筛选至抗性芽长1 cm 左右，将保持绿色的抗性芽转入生根培养基中长成完整植株。炼苗1～2 d，移入营养钵，置于温室内培养。

1.3.2 分子检测 PCR 检测：用CTAB法（Murry & Thomas，1980）分别提取转基因植株和非转基因植株（未经侵染的植株，CK）的总DNA，并以其为模板进行PCR 扩增。根据cry1Ia8基因序列设计引物，预扩增片段大小为769 bp，上游引物序列为5′-AGCCGTTTGTTAGTGCCT-3′，下游引物序列为5′-ACTTGGATGCGGATGGAC-3′，由上海生工生物工程股份有限公司合成。PCR 扩增体系：基因组DNA 4 μL，10×buffer 2 μL，dNTP 1.6 μL，cry1Ia8-F 0.8 μL，cry1Ia8-R 0.8 μL，Taq酶0.4 μL，ddH2O 10.4 μL。PCR 反应程序：94℃预变性4 min；94℃变性60 s，58℃退火 60 s，72℃延伸 90 s，30次循环；72℃延伸10 min。PCR 产物用1%琼脂糖凝胶电泳进行检测。

Southern blot 检测：取PCR 检测为阳性的转基因植株DNA 15 μg，经Fast Digest 快速限制性内切酶（购自赛默飞世尔科技公司）37℃酶切10 min，于1%琼脂糖凝胶中电泳分离，然后置于20×SSC溶液中过夜转膜，120℃条件下固定30 min；同时将目的基因质粒DNA 进行PCR 扩增，地高辛试剂盒（Roche 公司）标记其扩增产物作探针，过夜杂交，对杂交后的尼龙膜进行洗膜、显色、定影。

RT-PCR检测：取Southern blot检测为阳性的转基因植株，提取总RNA，逆转录合成cDNA第一链，进行PCR 扩增。cry1Ia8扩增引物序 列为cry1Ia8-F：5′-CAAAGCACTTACCGACCTC-3′；cry1Ia8-R：5′-CATTGACAGGGTGAGTGAGGA-3′，预扩增片段大小为893 bp； 以β-actin作为内参，扩增引物序列为β-actin-F：5′-ATCTGGCATCACACTTTCTAC-3′；β-actin-R：5′-ATCTCTTTGCTCATACGGTCT-3′，预扩增片段大小为697 bp。RT-PCR 扩增程序同PCR 扩增程序。

Western blot 检测：用Tris 缓冲液分别提取转基因植株和非转基因植株可溶性总蛋白。首先用SDS-PAGE 聚丙烯酰胺凝胶电泳分离蛋白样品，然后转膜，将蛋白转移至尼龙膜上，BSA 过夜封闭，加入一抗（Bt 毒蛋白的抗血清，工作浓度为1∶5 000，由中国农业科学院植物保护研究所提供），洗膜；加入二抗（碱性磷酸酯酶偶联的山羊抗兔IgG，工作浓度为1∶20 000，购于Sigma 公司），洗膜；最后用含NBT/BCIP 的显色液显色至出现目的条带。

1.3.3 转基因植株饲虫试验 采用室内离体叶片饲喂法，取苗期转基因植株及非转基因植株上部相同部位的幼嫩叶片，用打孔器打成直径为6 cm 的圆片，分别置于内置1 张湿润滤纸的直径为9 cm 的培养皿中。每个培养皿接种小菜蛾2 龄幼虫10 头，3次重复。置于（25±1）℃、16 h/8 h 光周期条件下培养，6 d后观察记录叶片受损伤程度，调查死虫数和活虫数，并计算小菜蛾幼虫的校正死亡率。

叶片受损分级标准（王欣 等，2007）：0级，叶片无咬食；1级，虫食面积在1/4 以内；3级，虫食面积1/4～1/2；5级，虫食面积1/2～3/4；7级，虫食面积在3/4以上。

1.3.4 转基因植株Bt 毒蛋白含量测定 取转基因植株叶片1 g，提取总蛋白。用磷酸缓冲液包被目的蛋白，4℃过夜；洗板，加入封闭液，37℃封闭1 h；洗板，加入一抗，37℃孵育1 h；洗板，加入二抗，37℃孵育1 h；避光加显色液，显色10～30 min；加终止液50 μL，在酶联检测仪490 nm 波长下测定OD值，计算Bt 毒蛋白含量。

2 结果与分析

2.1 转基因植株的获得

甘蓝遗传转化的各个阶段如图1所示，外植体转移到筛选培养基1个月后，部分外植体分化出愈伤组织，并长出再生芽；将绿色的再生芽切下，接种到生根培养基中，共获得37株卡那霉素抗性 植株。

图1 甘蓝遗传转化的不同阶段

2.2 转基因植株的PCR 检测

以转基因植株基因组DNA 为模板，以cry1Ia8质粒DNA 为阳性对照，以非转基因植株DNA 为阴性对照进行PCR 检测，共有23株转基因植株表现为阳性，部分结果如图2所示。其中，3、5、6、7、9 道的样本扩增出了大小为769 bp 的目的条带，4、8、10 道的样本没有相应条带产生。

图2 部分转基因植株的PCR 检测结果

2.3 转基因植株的Southern blot 检测

选取7株PCR 检测为阳性的甘蓝转基因植株，提取基因组总DNA。用地高辛试剂盒标记探针，进行Southern blot 检测分析，结果显示TF1、TF3、TF5、TF7植株均出现杂交信号（图3），证明外源基因cry1Ia8已整合到甘蓝基因组中。

图3 转基因植株的Southern blot 检测结果

2.4 转基因植株的RT-PCR 检测

提取Southern blot 检测为阳性的转基因植株的总RNA，以β-actin作内参对照，进行RT-PCR 检测。结果显示（图4），阴性对照和转基因植株样品中均有β-actin内参条带产生，转基因植株TF1、TF3、TF5与阳性对照均产生了大小为893 bp 的目的条带，但TF7未产生大小为893 bp 的目的条带，可能是由于外源基因发生了基因沉默。RT-PCR 检测结果表明，转基因植株的cry1Ia8基因在RNA 水平上得到了表达。

图4 转基因植株的RT-PCR 检测结果

2.5 转基因植株的Western blot 检测

提取Southern blot 和RT-PCR 检测均为阳性的转基因植株的可溶性蛋白，以cry1Ia8表达蛋白（分子量约81 kD）为阳性对照，进行Western blot 检 测。结果显示（图5），转基因植株TF1、TF3、TF5在约81 kD处均有杂交条带产生，而非转基因植株则无此条带。Western blot 检测结果表明，转基因植株的cry1Ia8基因在蛋白质水平上得到了表达。

图5 转基因植株的Western blot 检测结果

2.6 转基因植株饲虫试验

取3株转基因植株叶片，分别接种敏感小菜蛾和Cry1Ac 抗性小菜蛾的2 龄幼虫，鉴定转基因植株的抗虫效果。小菜蛾取食转基因植株叶片2 d后，身体开始逐渐僵硬，6 d 内陆续死亡（图6）；而对照植株被取食严重，植株上的小菜蛾生长发育正常。抗虫性鉴定结果表明（表2），转基因植株对敏感小菜蛾和抗性小菜蛾均具有较好的抗性。

图6 转基因植株离体饲虫试验结果

表2 转基因植株饲虫试验结果

图7 转基因植株叶片Bt 毒蛋白的ELISA 检测结果

2.7 转基因植株Bt 蛋白含量测定

采用ELISA 法检测cry1Ia8基因在各转基因植株中的蛋白表达量，结果如图7所示，TF1、TF3、TF5的Bt 蛋白表达量分别为241.8、210.5、201.9 ng·g-1（FW）。

3 结论与讨论

本试验利用农杆菌介导法将Btcry1Ia8基因导入早熟圆球型春甘蓝高代自交系中，并进行了DNA、RNA 和蛋白质水平上的分子检测，证明外源Bt基因已经整合到甘蓝基因组中并得到表达。但是部分转化植株在转录和翻译水平上并没有表达，可能是由于外源基因整合后的基因沉默导致的。造成基因沉默的原因主要有密码子的偏爱性、DNA 甲基化作用、存在基因同源序列及转录后水平的沉默等（Meyer，1998；Matzke et al.，2000），因此在甘蓝转基因中应采取有效避免基因沉默的方法，如选用植物偏爱的密码子、改造和修饰基因、使用增强子和启动子等，以提高外源基因在转基因植株中的高效表达。

获得的cry1Ia8基因转基因植株离体饲虫试验结果表明，转基因植株对敏感小菜蛾和Cry1Ac 抗性小菜蛾均具有较好的抗性，但抗虫性强弱存在差异，可能与目的基因整合位点的随机性和整合后的基因修饰导致转基因植株毒蛋白表达量不同有关（Matzke et al.，1994；Cao et al.，1999）。因此本试验又采用ELISA 法测定了转基因植株的Bt 毒蛋白表达量，结果表明Bt 毒蛋白表达量高的植株其抗性也较强，反之则抗虫性较弱。

近年来，随着植物基因工程技术的迅速发展，国内外许多研究者已利用转基因技术成功获得多种作物的转基因植株，为作物品种改良提供了新的机遇。但大多数转基因植物还处于基础研究阶段，对于外源基因在受体植物中的遗传稳定性的研究还不多。外源基因能否在受体植物中稳定遗传和表达是基因工程育种成败的关键。由于外源基因整合的方式不同，或者由于外源基因的丢失、重组和沉默等因素的影响，有些转基因作物农艺性状表现不佳、外源基因呈现不规则的遗传或蛋白表达量较低（Tu et al.，2000），给转基因植物在农业生产中的应用造成困难。因而，有待于进一步研究cry1Ia8基因在转基因甘蓝后代中的遗传稳定性，加速转基因甘蓝在实践中的应用。

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