（中国动物卫生与流行病学中心，山东青岛 266032）

我国部分省份猪流行性腹泻的流行病学监测

张 志，董雅琴，刘 爽，吴发兴，邵卫星，李晓成

（中国动物卫生与流行病学中心，山东青岛 266032）

[目的]为摸清我国猪群流行性腹泻的感染状况，[方法]从2011年底到2014年3月，对云南、广西等29个省份开展了猪群腹泻疫情流行病学调查，采集、收集了发生腹泻症状的发病猪群样品（新鲜粪便、肠道组织等），进行了猪流行性腹泻病毒（PEDV）、猪传染性胃肠炎病毒（TGEV）等多种病原检测。[结果]在7021个调查猪场中，出现腹泻的阳性猪场4060个（57.83%）。在收集的1383份腹泻样品中，利用RT-PCR方法检测到PEDV阳性样本686份（49.58%），其中腹泻发病猪样品中PEDV的检出率为67.82%，675份组织样品共检测出PEDV阳性样本86份（12.75%）。[结论]这表明我国猪场PEDV的感染十分普遍。对S基因进行分子流行病学分析发现，我国PEDV流行毒株与已有PEDV毒株可以分为2个完全不同的进化分支G1和G2，G1以CV777和DR13等疫苗株和早期毒株为主，G2则以2011-2013年流行毒株为主，流行毒株之间的同源性为97.8%-100%，与疫苗株CV777之间的同源性为94.3%-94.5%。

猪流行性腹泻；流行病学调查；监测

猪腹泻是影响猪群生产的一种常见性多发病，其致病因素较多，病毒、细菌、饲料等多种病因均可引发本病。2010年下半年开始，我国部分省份的猪群开始出现大规模的腹泻疫情，主要症状为猪水样腹泻、呕吐和脱水等特征，各种年龄猪和不同品种的猪群都有易感性，但对哺乳仔猪的危害性更大，1周内的仔猪一旦发病，死亡率往往可达80%～100%[1-2]。对发病样品进行病原鉴定，很多学者从中检测到了猪流行性腹泻病毒（Porcine Epidemic Diarrhea Virus，PEDV）[3-5]。2011年底至2014年3月，为进一步摸清我国猪群腹泻的发生现状和发展趋势，找出主要致病病原，我们在江西、湖南、广西、云南等29个省份动物疫病预防控制中心的配合下，对这29个省份的规模猪场开展了现场流行病学调查，针对猪群腹泻疫情的发生情况以及疫苗的使用情况进行了问卷调查、现场核查和统计分析，并收集、采集腹泻猪群的肠道（及其内容物）和粪便样品1383份进行PEDV等病原的检测，调查结果如下。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 样品。样品有2种：一是来自14个省份、192个发病猪场的1383份粪便、肠道及肠道内容物样品；二是来自12个省、60个屠宰厂的675份组织样品（包括肝脏、肺脏、腹股沟浅淋巴结、颌下淋巴结、脾脏和肾脏）。

1.1.2 试剂。PEDV的RT-PCR引物由本实验室自行设计。RNA提取试剂盒Trizol购自Invitrogen公司，反转录酶AMV、Taq酶等购自Takara公司，其余试剂均为分析纯产品。

1.2 方法

1.2.1 流行病学调查。2011—2013年，我们在江西、湖南、广西、云南等29个省份共开展四轮次猪群腹泻疫情的流行病学调查，共发放《猪群腹泻等常见病流行病学调查表》8000份，针对腹泻等猪群疫病的发生情况、疫苗使用情况进行了问卷调查、现场核查。调查内容涉及发病情况、发病区域、总体发病率、死亡率以及现有疫苗的临床免疫保护效果等，对返回的数据及时进行统计分析。

1.2.2 PEDV 核酸检测

1.2.2.1 猪粪便样品的处理和RNA的提取。每一份粪便按照1：5的比例加入PBS缓冲液，5000r/min 4℃离心10min，然后吸出上清液用于提取RNA和接种细胞。RNA的提取根据试剂盒的说明书进行，即取粪便悬液250μL于1.5mL的离心管中，加入750μL Trizol（Invitrogen公司），混匀，室温放置5min；再加入200μL氯仿，振荡混匀，室温放置10min；12000r/min、4℃离心15min，取上清500μL，加等体积-20℃预冷的异丙醇室温静置10min或-20℃静置30min，12000r/min、4℃离心10min；弃上清，加入75%冰冷乙醇（DEPC处理水配制），8000～9000g离心5min；弃上清，倒置风干，用20μLDEPC处理水溶解，-20℃冻存备用。

1.2.2.2 检测引物。根据参考文献[6]，设计2对引物，进行巢式PCR扩增，一扩引物的扩增产物预计为854 bp，序列为：L12：5’-ACACCTATAGGGCGCCTGTA-3’；L13：5’-AACCCTAAGAGGGGCATAGA-3’；二扩引物的扩增产物应为412 bp，其序列为： PA： 5’-GGGCGCCTGTATAGAGTTTA-3’；PB：5’-AGACCACCAAGAATGTGTCC-3’。引物由上海生工合成。使用时稀释至20μm。

1.2.2.3 RNA病毒的检测。首先制备cDNA，cDNA反应体系为：RNA 5μL，dNTP 4μL，5×AMV Buffer 4μL，反转录引物L131μL，AMV 0.5μL，HPRI 0.5μL，加入适量DEPC水，总体积为20μL。42℃恒温水浴锅中水浴1.5h，取出后放入-20℃冰箱保存备用。PCR扩增：取反转录的cDNA 2.0μL作为模板，加入10×PCR Buffer 2.5μL，dNTPs（10 mmol/L）2μL，分别加入PEDV的引物L12和L13各0.5μL，Ex-Taq DNA聚合酶0.25μL，ddH2O 17.25μL。混匀后采用如下程序进行PCR扩增：94℃预变性3min；94℃40s，56℃1min，72℃ 1min，30个循环；72℃延伸10 min。巢式PCR扩增：取上述PCR产物0.5μL，用引物PA和PB进行二次扩增，反应条件如下：94℃预变性3 min；94℃ 30s，56℃ 30s，72℃30s，32个循环；72℃延伸10 min。

1.2.2.4 PCR产物检测。取10μL 一次和二次扩增的PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳，在凝胶成像系统中进行观察有无特异性条带。

1.2.3 PEDV 分子流行病学分析

1.2.3.1 引物设计。根据GeneBank上的PEDV S基因序列，设计一对引物用于扩增S基因的S1片段，引物序列为：PDEV-S1-F：AAGTGGCGCTGTGATTGA和PDEV-S1-R：CAGAAAGAACTAAACCCATTGATA。扩增大小为1885bp。

1.2.3.2 S1片段的PCR扩增。取上述巢式PCR鉴定为阳性的RNA样品，进行反转录，然后再进行PCR扩增，反应程序为：94℃预变性3min；94℃ 40s，56℃2min，72℃ 1min，30个循环；72℃延伸10 min。

1.2.3.3 PCR产物检测。取10μL扩增的PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳，在凝胶成像系统中进行观察有无特异性条带，如果有阳性条带，则送交上海生工进行测序。

1.2.3.4 分子流行病学分析。从Genebank上下载PEDV S基因相关序列作为参考序列，用DNA-

Star、MEGA6.0、CLUSTAL W1.83等分子生物学软件比较和分析本试验中PEDV阳性样品的S1片段测序序列，分析PEDV流行毒株的变异和分子演化特征。

2 结果

2.1 流行病学调查结果

2.1.1 猪群腹泻流行病学调查结果。2011—2013年，每年开展四轮次猪群腹泻疫情的流行病学调查，共涉及29个省份，共发放流行病学调查问卷8000场次，实际回收问卷7021场次，主要类型为规模养猪场或养猪大户，母猪存栏量一般为50-3000头，并抽取10%-20%的猪场进行了现场核查（表1）。调查数据显示，养殖场出现腹泻临床病例的比例较高，2012年最高，场发病率达71.16%，2013年明显下降，场发病率为48.35%。腹泻的发病与猪的日龄密切相关，仔猪的发病率、死亡率明显高于种猪、育肥猪，种猪和育肥猪发生腹泻以后，二者的死亡率极低，但仔猪发生腹泻后，死亡率可达12.58%（2012年）。

2.1.2 PED疫苗临床应用效果调查结果。2011—2013年腹泻疫苗的临床使用效果调查数据显示，灭活苗使用率较高，为40.2%～51.6%，高于活疫苗使用率，但2013年，两种疫苗的使用率都有所下降，未使用疫苗的猪场明显增加，但同年猪场腹泻的发病率下降明显，从调查结果来看，不管是接种灭活苗还是活疫苗，对降低腹泻的发病率作用并不明显，详见图1。

2.2 PED病原学检测结果

2011—2013年对我国腹泻猪群的组织样品进行PEDV、TGEV和PRoV等三种常见病原学检测，发现在三种导致腹泻的病原中，PEDV的阳性率最高，2011年腹泻样品中PEDV的阳性率94.60%，2013年为17.60%（表2）。表明PEDV是导致我国腹泻疫情的主要病原。另外，对来自屠宰场的675份组织样品进行PEDV检测，阳性率为12.75%。

2.3 PEDV流行毒株的分子流行病学特点

对13份PEDV阳性病料中PEDV流行毒株的S基因的S1片段进行序列测定，与GenBank中的参考毒株进行比较，发现：流行毒株之间的同源性为97.8%～100%，与疫苗株CV777之间的同源性为94.3%～94.5%，与GeneBank中公布的PEDV流行株之间的同源性为97.4%～99.6%，表明2011—2013年PEDV的流行毒株之间高度同源，而与疫苗毒株之间已经发生较大变异（图2）。

表1 2011—2013年我国猪群腹泻流行病学调查结果

图1 2011—2013年腹泻疫苗的临床使用效果调查结果

表2 2011—2013年我国腹泻猪群病原学检测结果

另外，与疫苗株相比，流行毒株有2个位置已经发生了插入和缺失突变。第一个位置位于第166位碱基处，流行株均有12个碱基的插入突变，见图3a；第二个位置位于第481位碱基处，流行株均有6个碱基的缺失突变，见图3b。

进一步分析PEDV流行毒株的进化树，发现我国PEDV流行毒株与已有PEDV毒株可以

分为2个完全不同的进化分支G1和G2，G1以CV777和DR13等疫苗株和早期毒株为主，G2则以2011—2013年流行毒株为主，这些毒株包括来自韩国、泰国以及最近美国的流行毒株，详见图4。

图2 PEDV流行株与疫苗株同源性比较

图3a和3b PEDV流行毒株的插入和缺失突变图

3 讨论和分析

猪流行性腹泻是猪场常见的一种高度传播性疫病，其病理变化是猪出现呕吐、水样或黄白色粪便，猪只精神沉郁，食欲下降，急剧消瘦，在临床上很容易与其他疫病鉴别。本试验开展的流行病学调查时主要根据临床和病理变化做出初步诊断。在调查的7021个猪场中，有4060个猪场（57.83%）发生过腹泻，这表明猪场腹泻非常普遍和严重，已经成为严重危害猪场的重要疫病。从调查的省份来看，PEDV阳性省份已经有29个省市，覆盖了我国所有养猪的主要产区，由此可以看出，猪流行性腹泻病毒广泛存在，是近年来猪群腹泻疫情的主要病原。

在本试验中，我们发现无论是发病的腹泻样品还是屠宰场外观健康的猪组织样品，都可以检测到PEDV的存在，特别是发病的腹泻样品中，PEDV的阳性率最高可以达到94.60%，即使屠宰场样品PEDV的阳性率也为12.75%。Gao等[1]曾对我国北京、河北和浙江等15个猪场出现腹泻的样品进行了检测，PEDV的阳性率为92.7%（267/288）；Wang等[7]2010-2012年共收集了42个猪场的217份仔猪腹泻样品，PEDV阳性率为80.6%，传染性胃肠炎病毒8.3%。这说明PEDV的感染率已经非常普遍，PEDV已经成为初生仔猪腹泻的主要传染性病原。

通过S基因的遗传进化分析，我们发现2011—2013年的PEDV流行毒株均位于同一个进化分支，与原来的CV777、DR13等毒株处于另一个进化分支截然不同，这一结果与文献等[8-11]的结论类似。这说明目前PEDV的流行毒株与疫苗株之间有较大的差异，这种差异是否导致致病性、疫苗的免疫原性等变化尚待进一步研究。但通过本试验中的调查发现，现有的传染性胃肠炎-流行性腹泻二联灭活疫苗、二联活疫苗免疫接种效果与未免疫猪群出现腹泻的差异不明显，表明现有的PED疫苗并不能有效保护PED的发生和流行，为了有效地控制腹泻疫情，研发安全、有效的疫苗刻不容缓。

[1] Yueyi Gao，Qiuwen Kou，Xinna Ge，et al. Phylogenetic analysis of porcine epidemic diarrhea virus field strains prevailing recently in China[J]. Arch Virol，2013，158：711-715.

图4我国2013年PEDV分离毒株的进化树分析

[2] Qian Zhang，Ruiming Hu，Xibiao Tang，et al. Occurrence and investigation of enteric viral infections in pigs with diarrhea in China[J]. Arch Virol，2013，DOI 10.1007/s00705-013-1659-x.

[3] Sun R Q，Cai R J，Chen Y Q，et al. Outbreak of porcine epidemic diarrhea in suckling piglets，China[J]. Emerging Infectious Diseases，2012，18（1）：161-163.

[4] 张传亮，陈星宇，赵灵燕，等.浙江省猪病毒性腹泻流行病学调查及防控对策[J].中国动物检疫，2013，30（7）：47-48.

[5] Kwoen C.H.，Kwon B.J.，Jung T.S.，et al. Isolation of porcine epidemic diarrhea virus （PEDV） in Korea[J]. Kor J Vet Res，1993，33：249-254.

[6] 张志，李岚，董雅琴，等.猪流行性腹泻病毒PCR检测及其M基因的遗传变异分析[J].动物医学进展，2013，34（8）：13-18.

[7] Jinbao Wang，Pengwei Zhao，Lihui Guo，et al. Porcine Epidemic Diarrhea Virus Variants with High Pathogenicity，China[J]. Emerging Infectious Diseases，2013，19（12）：2048-2049.

[8] 郑逢梅，霍金耀，赵军，等.2011-2012年华中地区猪流行性腹泻病毒分子特征和遗传进化分析[J].病毒学报，2013，29（3）：197-205.

[9] Ge FF，Yang DQ，Ju HB，et al. Epidemiological survey of porcine epidemic diarrhea virus in swine farms in Shanghai，China [J]. Archives of virology，2013，158（11）：2227-2231.

[10] Qian Zhang，Ruiming Hu，Xibiao Tang，et al. Occurrence and investigation of enteric viral infections in pigs with diarrhea in China[J].Archives of virology，2013，158（8）：1631-1636.

[11] Xia Yang，Jinyao Huo，Lu Chen，et al. Genetic variation analysis of reemerging porcine epidemic diarrhea virus prevailing in central China from 2010 to 2011[J].Virus Genes，2013，46：337-344.

Survey and surveillance of porcine epidemic diarrhea in some provinces in China

Zhang Zhi，Dong Yaqin，Liu Shuang，Wu Faxing，Shao Weixing，Li Xiaocheng

（China Animal Health and Epidemiology Center，Qingdao 266032）

A series of epidemic surveys and surveillances were carried out in 29 provinces in China during 2011-2013. Some diarrhea samples of feces ，intestines and its contents were collected and detected for porcine epidemic diarrhea virus（PEDV），transmissible gastroenteritis virus（TGEV） and porcine rotavirus（PRoV）. The results showed that the total positive ratio of PEDV was 49.58%，whereas the positive ratio was 67.82% in diarrhea samples and 12.75% in healthy samples，suggesting the prevalence of PEDV was very common in pig farms. According to the molecular analysis with some

trains from GeneBank，the f eld strains of PEDV in the study could be classif ed into one subgroup with homology of 97.8%～100%，while vaccine strains of CV777，DR13 and some early strains were classif ed into another subgroup with homology of 94.3%～94.5% as compared with f eld strains.

porcine epidemic diarrhea；epidemic survey；surveillance

S852.65

：B

：1005-944X（2014）10-0047-05

李晓成