卜令军，李 玉，路福平，王正祥

(工业发酵微生物教育部重点实验室，工业酶国家工程实验室，天津市工业微生物重点实验室，天津科技大学生物工程学院，天津 300457)

利用木糖母液生产碱性蛋白酶发酵工艺的初步研究

卜令军，李 玉，路福平，王正祥

(工业发酵微生物教育部重点实验室，工业酶国家工程实验室，天津市工业微生物重点实验室，天津科技大学生物工程学院，天津 300457)

研究了以木糖工业化生产的副产物木糖母液为碳源，利用地衣芽孢杆菌工程菌(Bacillus licheniformis)TCCC11843发酵生产碱性蛋白酶的工艺．对摇瓶发酵工艺进行优化，确定了接种种龄为12,h，接种量为8%，培养基初始pH为6.5，发酵温度为34,℃，在24,h一次补加4.0,mL 质量分数为50%木糖母液，此时的发酵液酶活力峰值为7,838,U/mL；在此基础上，又在7,L发酵罐上实现了木糖母液的反馈补料，酶活力在80,h时达峰值，为14,912,U/mL．该结果为工业化生产碱性蛋白酶的发酵工艺优化提供了新的思路．

木糖母液；地衣芽孢杆菌；碱性蛋白酶；补料发酵

碱性蛋白酶是指水解蛋白质肽键的最适作用pH在碱性范围的一类蛋白酶类，其最适作用pH一般为9～11[1–3]，在洗涤剂生产、食品加工、医药、皮革制造、丝绸制造、环境保护等行业[4–9]都有应用．目前，碱性蛋白酶发酵生产主要利用地衣芽孢杆菌(Bacillus licheniformis)2709、枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)CW301、枯草芽孢杆菌CW302等菌株，以玉米粉、葡萄糖、蔗糖等作为碳源，这些碳源的利用势必消耗大量粮食资源，增加碱性蛋白酶的生产成本，因此，开发营养全面、价格低廉的优质碳源具有重要的经济效益和环境效益．

木糖母液是在木糖工业化生产中的副产物．在目前的木糖生产中，由于半纤维素水解液中尚存在葡萄糖等杂糖，浓缩糖液的黏度较大，影响了木糖的结晶得率；在分离出晶体木糖后的母液中，杂糖含量较高，即使再经过浓缩，也很难再使木糖结晶析出，从而产生大量的木糖母液[10–12]．木糖母液的主要成分为木糖、阿拉伯糖、葡萄糖、半乳糖等，价格大约只有2,000元/吨．如果能将木糖母液中的糖分充分利用起来，将带来巨大的环境效益与经济效益[13]．为降低生

产成本，汪东升等[14]对肺炎克雷伯氏菌利用木糖母液发酵生产2，3–丁二醇进行研究，并对发酵工艺进行优化，最终得到2，3–丁二醇质量浓度为35.7,g/L，比优化前提高了7.5,g/L，得率达到了理论得率的92%；周立国等[15]利用木糖母液生产的酱色素易溶于水、着色率高、红色素达到5.5以上，对温度、光照、pH耐受性强、稳定，十分适合调味品工业．木糖母液具有巨大的应用潜能，因此，本文选择木糖母液为碳源，利用前期已构建成功的地衣芽孢杆菌工程菌TCCC11843生产碱性蛋白酶，并优化其发酵工艺，提高碱性蛋白酶酶活，以期为工业化生产奠定基础．

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 菌种

地衣芽孢杆菌(Bacillus licheniformis)工程菌TCCC11843，保藏于天津科技大学生物工程学院酶与应用微生物研究室．

1.1.2 试剂

卡那霉素和L–酪氨酸，Sigma公司；干酪素，上海申翔化学试剂有限公司；福林试剂，北京索来宝科技有限公司；木糖母液，福田药业；豆粕粉，市售；脱脂奶粉，完达山乳业有限公司；其他试剂均为分析纯.

1.1.3 培养基

脱脂奶粉平板培养基(g/L)：胰蛋白胨10，酵母粉5，氯化钠10，脱脂奶粉10，琼脂20，卡那霉素30,µg/mL，pH 7.0．

种子培养基(g/L)：牛肉粉1.50，酵母粉1.50，蛋白胨5.00，磷酸二氢钾1.32，磷酸氢二钾3.68，葡萄糖1.00，氯化钠3.00，卡那霉素30,µg/mL，pH 7.0～7.2.

发酵培养基(g/L)：木糖母液40，豆粕粉45，硫酸铵5，氯化钙0.2，氯化钠0.63，磷酸氢二钠1.0，磷酸二氢钠0.65．

1.2 实验方法

1.2.1 发酵培养条件优化

采用单因素实验，在250,mL三角瓶(40,mL装液量)中分别考察种龄、初始pH、接种量和发酵温度对产酶的影响．种龄分别选取8、10、12、14、16,h；发酵培养基初始pH分别选取5.5、6.0、6.5、7.0、7.5、8.0、8.5；接种量分别选取2%、4%、6%、8%、10%；发酵温度分别选取25、28、30、34、37、40,℃．

1.2.2 发酵实验

利用发酵培养基、优化后的培养条件，在三角瓶中进行发酵实验，每隔8,h取样，测其酶活力和残糖质量浓度．

1.2.3 补料量的确定

根据在发酵培养基中的产酶情况，在24,h分别向三角瓶中补加2.0、3.0、4.0、5.0、6.0,mL质量分数为50%的木糖母液补料液，考察补料量对产酶的影响．

1.2.4 反馈补料发酵实验

在7,L发酵罐(4,L装液量)发酵过程中流加氨水，维持发酵液的pH为6.5．测定发酵液酶活力与残糖质量浓度，根据残糖质量浓度调整蠕动泵，改变补料速率，在发酵过程中维持残糖质量浓度为13,g/L左右．当残糖质量浓度小于11,g/L时，调大蠕动泵的流量以加大补料速率；当残糖质量浓度大于15,g/L时，调小蠕动泵的流量以减小补料速率．

1.3 测定方法

1.3.1 碱性蛋白酶活力的测定

采用GB/T 23527—2009[16]方法，在40,℃条件下每分钟水解酪蛋白产生1,µg酪氨酸，定义为1个蛋白酶活力单位．

1.3.2 发酵液残糖质量浓度测定

采用DNS法[17]测定残糖质量浓度．

2 结果与讨论

2.1 发酵培养条件的优化

2.1.1 种龄的确定

种龄对产酶的影响如图1所示．当种龄为12,h时，碱性蛋白酶活力最高，因此确定种龄为12,h．

2.1.2 初始pH的确定

培养基初始pH对产酶的影响如图2所示．初始pH为6.0～7.0时，有利于菌体产酶，初始pH为6.5时，碱性蛋白酶活力最高，当初始pH超过7.0时，酶活力开始下降．因此，确定培养基初始pH为

6.5．这一结果与黄文晶[18]、孙同毅等[19]在碱性蛋白酶的优化工艺中确定的pH为6.5～7.0一致，说明在此pH能够稳定地维持菌体的生长与产酶．

2.1.3 接种量的确定

接种量对产酶的影响如图3所示．当接种量为8%时，碱性蛋白酶活力最高，达到5,003,U/mL．因此，确定接种量为8%．当接种量过小时，菌体生长缓慢，发酵迟缓；接种量过大，则会因菌体生长过快而导致营养和氧气缺乏，有些初级代谢产物或次级代谢产物的产生对酶合成有抑制作用．

2.1.4 发酵温度的确定

发酵温度对产酶的影响如图4所示．

温度从25,℃升高到34,℃时，碱性蛋白酶活力逐渐升高，增加趋势明显，34,℃时酶活力最大，温度继续升高，酶活力开始逐渐下降．因此，确定发酵温度为34,℃．若温度过低，菌体生长缓慢，会因菌体量少而影响酶的分泌；温度过高，菌体代谢加快，指数期和稳定期会因此而缩短，使衰亡期提早出现．另外，在高温下酶的热稳定性差，易变性失活．

2.2 地衣芽孢杆菌工程菌TCCC11843在发酵培养基中的发酵进程

地衣芽孢杆菌工程菌TCCC11843在三角瓶中发酵进程如图5所示．糖分在发酵初期缓慢消耗，8,h后质量浓度迅速下降，可能是菌体大量生长消耗了发酵液中的糖分；在24,h时的残糖质量浓度下降为13.6,g/L，之后糖的消耗速率减慢．因此，确定24,h为补糖时间点．在前24,h发酵液中酶活力较低，随后，发酵液中的酶活力迅速升高，至64,h时，酶活力达到峰值，为5,297,U/mL．

2.3 补料量对产酶的影响

根据木糖母液在发酵过程中的消耗情况，在24,h时向摇瓶中补加质量分数为50%的木糖母液补料液，补料量对产酶的影响如图6所示．

在考察的补料量范围内，补料量为4,mL时的酶活力峰值最大，为7,838,U/mL，相比于同一批次未补

加木糖母液时的酶活力峰值(5,137,U/mL)提高了52.5%．可以看出，选择合适的补料时机和补料量，即在发酵液中的残糖消耗殆尽时及时补加适量的木糖母液，能够较好地维持菌体的生长与产酶，而又不会因糖浓度过高而对产酶产生抑制作用．

2.4 残糖反馈补料发酵过程分析

残糖反馈补料发酵结果如图7所示．发酵液中的糖分在8,h内消耗缓慢，此时菌体处于延滞期，代谢速率缓慢；8,h后糖分的消耗速率开始加快，24,h时发酵液中糖分无法继续消耗，开启蠕动泵开始反馈补料，在24～48,h补料时间内，补入的糖被及时消耗，残糖质量浓度未出现大的波动；在48,h时补料结束，此时残糖质量浓度为13.1,g/L，残糖几乎消耗殆尽；发酵液酶活力24,h后开始迅速上升，在80,h时达到峰值，为14,912,U/mL．可见，残糖反馈补料的方式消除了底物抑制作用对发酵过程的影响，且能更好地与菌体的生长、产酶条件相吻合，有利于提高酶活力．

3 结 语

本实验以木糖母液为碳源、利用地衣芽孢杆菌工程菌TCCC11843发酵生产碱性蛋白酶，优化了发酵培养工艺：种龄12,h，初始pH,6.5，接种量8%，发酵温度34,℃，24,h补加4.0,mL质量分数为50%的木糖母液．利用7,L发酵罐进行反馈补料实验，酶活力在80,h时达最大值，为14,912,U/mL．虽然实验结果与目前碱性蛋白酶的工业生产水平尚有一定差距，但木糖母液价格低廉，有一定的成本优势，并且还可对其进行更大规模发酵实验，进一步优化生产工艺，提高产酶水平．

［1］ Gupta R，Beg Q，Khan S，et al. An overview on fermentation downstream processing and properties of microbial alkaline proteases[J]. Applied Microbiology and Biotechnology，2002，60(4)：381–395.

［2］ Rao M B，Tanksale A M，Ghatge M S，et al. Molecular and biotechnological aspects of microbial proteases[J]. Microbiology and Molecular Biology Reviews，1998， 62(3)：597–635.

［3］ Deng A，Wu J，Zhang Y，et al. Purification and characterization of a surfactant-stable high-alkaline protease fromBacillussp. B001[J]. Bioresource Technology， 2010，101(18)：7100–7106.

［4］ Gupta R，Beg Q，Lorenz P. Bacterial alkaline proteases： Molecular approaches and industrial applications[J]. Applied Microbiology and Biotechnology，2002，59(1)： 15–32.

［5］ Bhaskar N，Sudeepa E S，Rashmi H N，et al. Partial purification and characterization of protease ofBacillusproteolyticus-CFR3001 isolated from fish processing waste and its antibacterial activities[J]. Bioresource Technology，2007，98(14)：2758–2764.

［6］ Sareen R，Mishra P. Purification and characterization of organic solvent stable protease fromBacillus licheni-formisRSP-09-37[J]. Applied Microbiology and Biotechnology，2008，79(3)：399–405.

［7］ Anwar A，Saleemuddin M. Alkaline proteases：A review[J]. Bioresource Technology，1998，64(3)：175– 183.

［8］ Maase F W J L，Van Tilburg R. The benefit of detergent enzymes under changing washing conditions[J]. Journal of the American Oil Chemists’ Society，1983，60(9)： 1672–1675.

［9］ Von der Osten C，Branner S，Hastrup S，et al. Protein engineering of subtilisins to improve stability in detergent formulations[J]. Journal of Biotechnology，1993，28 (1)：55–68.

［10］ 刘鹏先，肖力. 木糖的制备研究[J]. 华西药学杂志，1995，10(3)：185–196.

［11］ 秦玉楠. 木糖的生产工艺及其效益[J]. 环境保护，1996(3)：24–26.

［12］ 万成志. 玉米芯生产木糖的工艺技术[J]. 应用科技，1998(7)：12–13.［13］ 王玉萍. 木糖母液的综合利用[D]. 重庆：重庆大学，2007.

［14］ 汪东升，张翠英，彭晓培，等. 木糖母液发酵生产2，3–丁二醇的研究[J]. 食品研究与开发，2012，33(7)：132–135.

［15］ 周立国，高俊杰. 木糖废液制取酱色素方法及其产品的稳定性研究[J]. 现代化工，2001，21(4)：33–35，41.

［16］ 中华人民共和国国家质量监督检验检疫总局，中国国家标准化管理委员会. GB/T 23527—2009 蛋白酶制剂[S]. 北京：中国标准出版社，2009.

［17］ 王俊丽，聂国兴，李素贞，等. DNS法测定还原糖含量时最适波长的确定[J]. 河南农业科学，2010，4(4)：115–118.

［18］ 黄文晶. 高产碱性蛋白酶重组菌及其发酵性能[D]. 无锡：江南大学，2012.

［19］ 孙同毅，殷向斌，郝继兴，等. 高活力碱性蛋白酶产生菌的选育与发酵放大[J]. 辽宁工程技术大学学报：自然科学版，2009，28(4)：679–682.

责任编辑：常涛

Alkaline Protease Fermentation Process Using Xylose Mother Liquor

BU Lingjun，LI Yu，LU Fuping，WANG Zhengxiang
(Key Laboratory of Industrial Fermentation Microbiology，Ministry of Education，National Engineering Laboratory for Industrial Enzymes，Tianjin Key Laboratory of Industrial Microbiology，College of Biotechnology，Tianjin University of Science & Technology，Tianjin 300457，China)

In this study，engineeredBacillus licheniformisTCCC11843,was used for the fermentation production of alkaline protease from a carbon source：xylose mother liquor，a by-product of xylose production. The optimized fermentation parameters of alkaline protease production were：inoculum culture age was 12,h，initial pH 6.5，inoculum volume 8%，fermentation temperature 34,℃，and feeding 4.0,mL 50% xylose mother liquor at the 24th,h. Under such optimal fermentation conditions，the maximum enzyme activity can reach 7,838,U/mL. Moreover，feedback feeding experiments using the 7,L fermenter resulted in the maximum enzyme activity of 14,912,U/mL at 80,h. These results are valuable for the optimal commercial production of alkaline protease.

xylose mother liquor；Bacillus licheniformis；alkaline protease；fed-batch fermentation

Q814.4

A

1672-6510(2014)06-0032-04

10.13364/j.issn.1672-6510.2014.06.007

2014–05–04；

2014–07–01

国家高技术研究发展计划“863计划”资助项目(2011AA100905-4)；教育部长江学者和创新团队发展计划资助项目(IRT1166)

卜令军（1988—），男，山东济南人，硕士研究生；通信作者：路福平，教授，lfp@tust.edu.cn.