孙 佳，邵荣花，高卫真△

(1.天津泰达医院药剂科,天津 300457；2.天津医科大学,天津 300070)

半夏属中药的凝集素与其他属性天南星科的中药植物凝集素相同，均具有专一结合甘露糖的3个位点，并具有显著的中药抗虫性[1]。本文参照已知半夏中凝集素的基因序列进行引物设计[2]，选择PCR-RT法，自5种中药半夏中分别克隆出凝集素的基因片段，并选择相应软件对凝集素的基因片段分别给予分析，旨在研究半夏属中药凝集素的序列分析以及基因片段的克隆方法，为成功转移到其他药材植物中作准备，现报道如下。

1 材料与方法

1.1 供试材料

所选材料分别为三叶半夏、掌叶半夏、滴水珠半夏、石蜘蛛半夏和盾叶半夏。

1.2 方法

表1显示，对半夏属植物的总RNA进行提取，选择某公司提供的提取试剂盒，参照试剂盒说明按步骤操作。选择某公司提供的反转录试剂将cDNA的第一链合成。

表1 半夏RNA提取步骤

1.3 PCR-RT与引物的设计

参照掌叶半夏中药凝集素的基因编码中，其cDNA的序列信息对引物进行设计合成。其PCR的反应体系是 PCR ×1buffer，每L含1.5 mmol的MgCl2，其酶为1U的Taq，其引物为每升0.25 μmol/L，其模板为每升100 ng的cDNA与0.2 mmol/L 的dNTP，总体积是25μL。其中PCR的扩增程序是60℃温度下30 s退火，于94℃下30 s变性，72℃下1 min延伸，共完成循环35个，最后72℃温度下10 min延伸，将PCR产物选择1%的琼脂糖应用凝胶电泳给予检测。

1.4 中药凝集素的基因克隆与基因鉴定

将扩增产物应用1%的琼脂糖凝胶给予电泳并回收实施纯化，同T-pMD19载体进行连接，直至转化为感受态的DH5a当中，再将单菌落挑取，并接种于含有每升100 mg、LB联合Amp的培养基中，保持37℃状态下过夜培养。……