徐晓娟，秦旭华，王婧婧，王 张,黄立华，钟艳梅

(1.成都中医药大学， 成都 611137；2.成都市第七人民医院， 成都 610075)

子宫内膜异位症(endometriosis，EM)是育龄妇女中的常见病和多发病，该病属于中医学“癥瘕”等范畴，近年来有明显上升趋势，已成为严重影响中青年妇女健康和生活质量的妇科难治性疾病之一。内异康复片是成都中医药大学附属医院多年来临床治疗EM的特色院内制剂，处方源于临床验方，疗效确切。前期实验研究发现[1～3]，对子宫内膜异位症模型大鼠、小鼠可降低血液黏度，促进血液流动，有改善微循环、抑制异位内膜血管的生成、促进异位内膜萎缩等作用。为深入探讨其作用机理，我们采用体内体外实验研究方法对内异康复片治疗EM机制进行了进一步的探讨。

1 材料

1.1 药物

内异康复片由大血藤、半枝莲、熟大黄、桃仁、水蛭等10余味中药组成，每片0.3 g，100片/瓶(批准文号川药制字Z20070659)，成都中医药大学附属医院生产(批号20120403)。疗程3个月，成人日用量每日3次，每次服用4～6片。来曲唑片，每片2.5 mg，12片/盒，江苏恒瑞医药股份有限公司生产(批号2012-03-20)。

体外实验时，首先用乳钵将内异康复片捣碎，采用密闭容器，于4 ℃冰箱内以DMEM培养液浸泡内异康复片72 h(比例为0.1 g/ml，其中超声振荡助溶2 h)，取上清液，0.22 μm微孔滤器过滤后，得到内异康复片浸提液，实验时用DMEM培养液稀释至所需浓度使用；来曲唑片用DMEM培养液溶解，0.22 μm微孔滤器过滤后使用。

1.2 试剂

DMEM培养基，赛默飞世尔生物化学制品(北京)有限公司(批号NXE0631)；无支原体胎牛血清，浙江天杭生物科学有限公司(批号111020)；美国R&D公司(进口分装)，Rat-Estradiol Elisa Kit(批号13051201)；美国R&D公司(进口分装)，Rat-Aromatase Elisa Kit(批号13051201)；美国ADL公司，Rat Cyclooxygenase-2 Elisa Kit(批号RT130371)。

1.3 动物

SPF级雌性SD大鼠，体质量200～250 g，成都中医药大学实验动物中心提供(实验动物合格证号SCXK(川)2004-12)。

1.4 仪器

德国HERA cell CO2培养箱，Thermo Labsystems Multiskan MK3全自动酶标仪，Heal Force公司HFsafe-1200型Safety Cabinet。

2 方法

2.1 体内实验研究

2.1.1 分组 设模型对照组、去势组、阳性对照组(来曲唑片，相当于成人剂量的7倍，具体剂量见后表)及内异康复片高、中、低3个剂量组(相当于成人剂量的14倍、7倍、3.5倍，具体剂量见后表)，每组各10只动物。

2.1.2 实验方法 雌性SD大鼠60只，适应性饲养2周，监测大鼠动情周期，在大鼠动情周期的动情期进行手术造模。按参考文献方法[4]无菌条件下进行，采用5%戊巴比妥钠(50 mg/kg)腹腔注射麻醉大鼠。将大鼠固定于手术台上，从尿道上端约1 cm处切开皮肤肌肉约3 cm，取出一侧子宫，结扎子宫两端血管，剪下一段子宫放入生理盐水中将剖开，剥去肌层留下子宫内膜，将5 mm×5 mm的子宫内膜缝在血管丰富的腹壁(其表面对着腹壁)并缝合切口。术后肌注庆大霉素防止感染，常规饲养。术后从第3周起开始进行药物干预，即除模型组外，各组给予内异康复片或来曲唑片灌胃每日1次(模型空白组和去势组给予等体积生理盐水灌胃)，持续3周。末次给药后24 h，大鼠眼眶取血分离血清，采用ELISA法检测血清中E2、ARO、COX-2水平(ELISA检测操作按试剂盒说明书进行)。

2.2 体外实验研究

2.2.1 异位内膜细胞体外培养方法 EM模型大鼠造模方法同前，造模3周后再次打开大鼠腹腔，将异位的内膜组织取出，此时异位内膜成囊泡状，囊泡内可见淡黄色透明积液者为造模成功的异位内膜组织。按文献方法[5]，将大鼠异位内膜组织置于冰盒上剪碎至糊状，置入离心管中加入5倍体积的胶原酶I(2 g/L)，37 ℃消化1 h(其间30 min时吹打1次)，用含10%胎牛血清的DMEM培养基终止消化，吸取细胞悬液。800 r/min，离心3 min后弃上清，加入无血清DMEM培养基重新吹打后，再次离心弃上清，最后将沉淀的细胞中加入含10%血清的DMEM培养基，稀释成1×106/ml浓度的单细胞悬液，接种到24孔板上，置37 ℃ 5%CO2、饱和湿度的细胞培养箱中培养6 h。待大部分细胞贴壁后，设细胞空白对照组、药物干预组，每组均设4个复孔。细胞空白对照组用等体积DMEM培养液代替受试药物，药物干预组加入不同浓度的药物，每个浓度设4个复孔，药物作用48 h后(药物具体浓度见后表)收集细胞上清液，ELISA检测E2、ARO、COX-2水平(ELISA检测操作按试剂盒说明书进行)。

2.3 统计学方法

采用《中国医学百科全书·医学统计学》统计软件PEMS3.1进行统计分析。

3 结果

3.1 内异康复片对EM模型大鼠血清中E2、ARO、COX-2水平的影响

表1 内异康复片对EM模型大鼠血清中E2水平的影响

注：模型对照组比较:*P<0.05，**P<0.01

表1显示，与模型组比较，内异康复片高、中剂量组使EM模型大鼠血清中E2水平明显下降(P<0.01或P<0.05)；内异康复片高剂量组使EM模型大鼠血清中ARO水平明显下降(P<0.05)，内异康复片中、低剂量也有一定的降低趋势；内异康复片高、中剂量组血清中COX-2水平明显下降(P<0.05)，其他各组无明显影响。

3.2 内异康复片对大鼠异位内膜细胞分泌的E2、ARO、COX-2水平的影响

表2显示，与细胞空白对照组比较，内异康复片在各个剂量下使EM模型大鼠异位内膜细胞分泌的E2水平明显下降(P<0.01或P<0.05)；内异康复片在0.05 ml/L使异位内膜细胞分泌的ARO水平明显下降(P<0.05)；内异康复片在各个剂量下使异位内膜细胞分泌的COX-2水平明显下降(P<0.01或P<0.05)，而其他组无明显影响。

表2 内异康复片对EM模型大鼠异位内膜细胞分泌E2水平的影响

注：细胞空白对照组比较：*P<0.05，**P<0.01

4 讨论

内异康复片是成都中医药大学附属医院多年来治疗EM颇具特色的妇科重点院内制剂，该方以我校附属医院妇科治疗内膜异位症的验方为基础，后不断结合妇科临床治疗该病经验反馈精心研制而成。内异康复片曾先后被命名为化瘀止痛片、消瘤片2号，该方由大血藤、半枝莲、桃仁、土鳖虫、鳖甲、三棱、莪术、薏苡仁等药物组成。方中大血藤败毒抗癌、活血通络，半枝莲具有清热解毒、散瘀活血作用，桃仁活血祛瘀，土鳖虫、鳖甲破血祛瘀，三棱、莪术破血行气，薏苡仁健脾渗湿，全方共奏清湿化瘀、行气止痛、消癥散结之效，是以活血化瘀治疗EM的验方。该制剂在我院临床使用时间已长达30余年，患者数万人，取得了肯定的疗效。但长期以来，对其现代机理的研究尚显不足。本课题在四川省中医药管理局应用基础科研基金的资助下，课题组从EM的现代机理入手，从体内外两方面较为系统地考察了内异康复片对EM模型动物的影响。体内实验研究采用手术方法建立EM模型大鼠，研究了内异康复片对该病模型大鼠E2、ARO、COX-2水平的影响；体外实验研究采用细胞培养的方法，直接观察药物对异位内膜细胞分泌E2、ARO、COX-2的影响，同时在实验中选用作用机理明确的现代药物来曲唑对照观察。由于动物血清本身含有较多的生物活性物质，可刺激细胞的生长，故在本次体外实验研究中，我们未采用含药血清进行研究。

芳香化酶(Aromatase，ARO)是雌激素生物合成过程中最后一步的限速酶，属于细胞色素P450超家族，其过度表达于子宫内膜癌、乳腺癌、子宫平滑肌瘤等雌激素依赖性疾病中。芳香酶在EM组织中异常表达，局部组织雌激素浓度升高，从而促进异位内膜生长[6～8]。因此，如果能够抑制芳香化酶活性，即可抑制E2的生成水平。由于现代药物来曲唑有此功效，故在研究中我们选择它为阳性对照药物。

本次研究结果发现，内异康复片可明显降低EM模型大鼠血清中E2水平(P<0.05，P<0.01)，体外实验也表现出相似的结果，且药效呈浓度依赖性关系，该作用与来曲唑相似。研究同时发现，内异康复片降低E2水平的机理也与其抑制芳香化酶直接相关。

通过本次实验发现，在抑制芳香化酶活性从而降低E2生成水平这方面的作用机制上，内异康复片具有与来曲唑相似的作用和功效。但内异康复片与来曲唑也有明显的不同之处，即内异康复片同时具有一定的抑制2型环氧化酶(Cyclooxygenase-2，COX-2)的作用。目前在EM的发病过程中，有学者认为COX-2也参与了雌激素的生物合成，发现EM中芳香化酶mRNA与COX-2 mRNA的表达水平呈正相关，表明芳香化酶与COX-2协同作用导致EM病灶局部雌激素合成增加，促进EM的发生发展[9]。在本实验中我们发现，内异康复片也具有明显的抑制COX-2活性的作用(P<0.05)，而这一作用与来曲唑明显不同。

综上所述，内异康复片不仅可降低EM模型大鼠血清中E2水平，其机制与抑制E2生成的关键酶芳香化酶有关，同时内异康复片还具有抑制COX-2酶活性的作用，反映出传统中药复方制剂内异康复片在临床上可以具有多环节、多靶点发挥治疗EM作用的特点，该研究为内异康复片更好地运用于临床提供了科学的实验研究依据。

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[2] 徐晓娟．化瘀止痛片治疗子宫内膜异位症的临床观察[J]．成都中医药大学学报，2004，27(2)：1-3．

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[4] 张婷婷，秦保锋，曹阳，等．中药红藤方对大鼠的异位子宫内膜芳香化酶表达的影响[J]．生殖与避孕，2008，28(7)：385-390．

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