李喜香，禚 君，豆金彦，刘军刚，高小恒，黄清杰

(甘肃省中医院，兰州 730050)

口腔溃疡是常见的口腔黏膜疾病，发病率为20%[1]，表现为口腔灼烧痛、溃烂，呈周期性、游走性反复发作难于治愈，直接影响患者的进食、吞咽和说话等日常生活。其溃疡面成圆形或卵圆形，凹陷且周围充血，创面刺激引发疼痛，现代医学对其尚无较好的治疗方法。研究发现[2]，免疫功能紊乱是口腔溃疡发生的最重要原因，感染、遗传、微量元素(锌、铁)和维生素VitB12缺乏、口腔黏膜局部微循环障碍和精神神经功能紊乱等诸多因素均可导致该病的发生和加重。养阴生肌膜是对养阴生肌散剂型改造而制得的膜剂[3]。前期研究发现，养阴生肌膜对口腔溃疡模型大鼠具有一定的治疗作用[4]。本文进一步研究养阴生肌膜对大鼠实验性口腔溃疡的治疗作用，并探讨其作用机理。

1 材料

1.1 动物

SD大鼠140只，SPF级，雌雄各半，体质量200±20 g,由甘肃中医学院科研实验中心提供(合格证号SCXK(甘)2011-0004)。

1.2 药品与试剂

养阴生肌膜，甘肃省中医院制剂中心；苯酚，天津市天骄制药有限公司(批号000126)；乙醚，天津市中建化工有限公司(批号20120106)；甲醛，上海金泓化工有限公司(批号20110925)。大鼠TNF-a酶联免疫试剂盒、IL-2酶联免疫试剂盒，均由南京建成生物制品有限公司提供(批号20130902-01)。

1.3 主要仪器

电子天平(德国sartorius)，TGL-16G高速低温离心机(上海安亭科学仪器厂)， OLMPUS显微镜(奥林帕斯公司出品)，大恒细胞分析系统(中国大恒集团有限公司)，TEC5组织包埋机(北京怡康勇佳科技有限责任公司)，全自动密闭式组织脱水机(北京怡康勇佳科技有限责任公司)，RM2135石蜡切片机(德国Leica 公司)，SP-Max 2300A酶标仪(上海闪谱生物科技有限公司)。

2 方法

2.1 模型复制

取大鼠84只，随机预留14只为空白对照组，其余大鼠参考文献[5]并改进方法，用医用乙醚吸入麻醉，取一直径为5 mm的塑料管，将小棉球(约20 mg)用30 μL 95% 的苯酚溶液浸透后置于塑料管一端(与塑料管管口取平)，将塑料管置于麻醉大鼠左侧颊黏膜上，保留60 s，用生理盐水清洗灼烧面。24 h 后观察，左侧实验区形成直径约3 mm的圆形溃疡，表面有黄白色脓肿，与周边分界明显，周围黏膜红肿充血，表明模型复制成功。

2.2 分组与给药

将造模成功的大鼠随机分为模型对照组、阳性对照组(氯已定地塞米松口腔溃疡膜)、养阴生肌膜高、中、低剂量组5组，每组14只。空白对照组正常饮食饲养，不做任何干预；模型对照组每日1次给予生理盐水冲洗；其余各组分别进行药物干预，乙醚吸入麻醉后，将药膜贴于溃疡面处，保持5 min，直至药膜溶化后，生理盐水冲洗。阳性对照组给予5×5 mm2复方氯已定地塞米松膜，养阴生肌膜高、中、低剂量组分别给予5×5 mm2养阴生肌膜(按文献[3]制备，每25 mm2分别含药78.6、39.3、19.6 mg)，给药后1 h内禁食禁水，每日给药1次，连续8 d。

2.3 观察指标及检测方法

2.3.1 溃疡面[6]造模后每日观察大鼠溃疡面基本形态，测量溃疡面直径，于给药第2、4、6、8天用透明玻璃纸描记溃疡面，用 Image-pro Plus 图像分析软件测量其面积大小。

2.3.2 平均愈合速度 每日拍照记录大鼠溃疡面愈合情况，记录每只大鼠溃疡完全愈合时间，计算各组平均愈合时间及平均愈合速度。平均愈合速度( mm2/d)=溃疡面积(mm2)/愈合时间(d)。

2.3.3 血清TNF-a 和 IL-2 含量 末次给药后1 h，各组大鼠麻醉后腹主动脉采血，4 ℃静置2 h后，3000 r/min离心15 min，取上清液，按试剂盒操作步骤分别测定血清TNF-a 和 IL-2 含量。

2.3.4 组织病理学检查 第4天和第8天给药后1 h，随机抽取各组大鼠4只，麻醉后剪取溃疡部位组织，用无菌生理盐水冲洗，4%中性多聚甲醛固定，梯度脱水，石蜡包埋、切片、HE染色，光镜下进行病理组织学观察。

2.4 统计学方法

3 结果

3.1 养阴生肌膜对溃疡愈合面积的影响

表1显示，与模型对照组比较，给药第4、6、8天养阴生肌膜高、中剂量组的溃疡面积缩小明显，差异有统计学意义(P<0.01)。

表1 大鼠口腔溃疡面积变化情况

注：与模型对照组比较:**P<0.01，*P<0.05

3.2 养阴生肌膜对口腔溃疡平均愈合时间及速度的影响

表2显示，与模型对照组比较，养阴生肌膜高、中剂量组大鼠口腔溃疡平均愈合时间明显缩短，平均愈合速度明显加快，差异均有统计学意义(P<0.01，P<0.05)。

表2 溃疡平均愈合时间及速度比较

注：与模型对照组比较：**P<0.01，*P<0.05

3.3 养阴生肌膜对血清TNF-a 和 IL-2 水平的影响

表3显示，与空白对照组比较，模型对照组血清 TNF-α水平明显升高，血清IL-2水平明显降低，差异均有统计学意义(P<0.01，P<0.05)；与模型对照组比较，养阴生肌膜高、中剂量组血清TNF-α明显降低，IL-2 水平明显升高，差异有统计学意义(P<0.01)。

3.4 组织病理学改变

给药第4天，空白对照组大鼠口腔黏膜形态正常，未见组织坏死和上皮细胞缺损，未见充水和炎性细胞浸润；模型对照组病灶区多见组织坏死，表层鳞状上皮缺失，渗出物多，固有层及肌层组织明显充血水肿，大量中性粒细胞、淋巴细胞、吞噬细胞浸润；阳性对照组病灶区表层上皮及固有层坏死，大量炎细胞浸润，新生的肉芽组织形成，血管丰富，肌层可见肌细胞变性、坏死，部分肌纤维增粗，肌细胞核内移；养阴生肌膜高剂量组病灶区表层上皮坏死缺失，渗出物多，组织水肿明显，大量炎细胞浸润。固有层浅层坏死，新生肉芽组织形成，血管丰富；中剂量组程度较重；低剂量组病灶区大片组织坏死明显，表层上皮缺失，渗出物多，固有层及肌层组织明显充血水肿，大量炎细胞浸润(见图1)。

表3 养阴生肌膜对血清TNF-α、IL-2水平的影响

注：与空白对照组比较：##P<0.01，#P<0.05；与模型对照组比较：**P<0.01，*P<0.05

图1 给药第4 d各组大鼠口腔黏膜组织病理学变化

给药第8天，空白对照组大鼠口腔黏膜形态正常，模型对照组病灶区新生上皮组织部分处于分离状态，尚未完全覆盖，渗出物基本消失，固有层中肉芽组织仍较丰富，炎细胞浸润，可见中性粒细胞、纤维母细胞增生。肌层中肌细胞核大、淡染，处于增生阶段。组织中血管较大，血细胞较多；阳性对照组和养阴生肌膜高剂量组病灶区新生上皮组织完整覆盖，肉芽组织已转化为瘢痕组织，肌肉层修复完全，未见炎细胞；中剂量组病灶区新生上皮组织完全覆盖，固有层为瘢痕组织，血管减少，纤维母细胞增生，胶原纤维丰富，肌层修复完整；低剂量组新生上皮组织尚未完全覆盖，固有层中炎细胞浸润明显，血管较多，肉芽组织仍存在，纤维母细胞增生，可见肥大细胞。肌层肌纤维粗细不一，仍处于增生阶段(见图2)。

图2 给药第8天各组大鼠口腔黏膜组织病理学变化

4 讨论

细胞因子在复发性口腔溃疡(recurrent oral ulcer，ROU)发病炎症损伤及其抗炎修复中具有非常重要的意义[7]。机体受到侵袭时，释放炎症因子引起炎症反应，同时产生一系列抗炎因子，以维持机体的平衡稳态，能有效减少ROU的复发，减轻患者的痛苦。白细胞介素、干扰素、TNF-β、生长因子、集落刺激因子等的表达，其他一些外界、机体的因素都可能会影响 ROU 的发生发展，TNF-α 和 IL-2 表达水平的改变对 ROU 有一定的疗效[8]。TNF-α 是ROU发病中很重要的损伤性细胞因子之一[8，9]，炎性细胞所分泌的 TNF-α 能进一步损伤组织，放大炎症反应。因此抑制 TNF-α 的合成、分泌，能有效地抑制局部炎症反应。IL-2 可以有效改善 ROU 患者的细胞免疫功能，是促进 T 细胞由 G1 期进入 S 期最重要的细胞因子，并具有促进 B 细胞增殖、分化、合成抗体，诱导许多细胞因子产生和细胞因子受体表达等生物学功能，同时 IL-2 受体的表达可活化外周血淋巴细胞，调节复发性口腔溃疡患者 IL-2 的血浆水平，增强口腔黏膜抵抗病原微生物的能力，促进溃疡面的愈合。养阴生肌膜能显著降低 TNF-α 水平，同时也能明显提高 IL-2水平。本研究结果表明，养阴生肌膜组大鼠口腔溃疡上皮细胞损伤减轻，直径明显缩小，症状明显缓解，这可能与TNF-α、IL-2水平的改变有关。

[1] 梁文红, 刘建国, 郭玉苏,等. 茶多酚对复发性阿弗它溃疡大鼠模型外周血 T 淋巴细胞亚群的影响[J] .口腔医学研究, 2005, 21( 4):393-395.

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[3] 李喜香,罗燕梅,罗文蓉,等.养阴生肌膜工艺条件的筛选[J].中国实验方剂学杂志,2009,15(8):43-45.

[4] 刘效栓,禚君,李季文,等.养阴生肌膜主要药效学实验研究[J].实用中医药杂志,2011,27(8):512-513.

[5] 朱萱萱,王广基,刘建平,等.口腔膜治疗实验性大鼠口腔溃疡作用机理研究[J].中医药学刊,2003,21(1):84-85.

[6] 陈嵘, 叶楠, 周威. 芦荟液- 表皮生长因子复合医用胶促进大鼠口腔溃疡愈合的研究[ J] .牙体牙髓牙周病学杂志,2009, 19 (8):449-450.

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