梁 辉，黄洁杰，周熙琳，王文安

血栓性疾病包括动脉血栓和静脉血栓，是老年性疾病的病因之首及病死的重要原因。老年人容易出现血栓栓塞的原因是动脉发生粥样硬化及斑块脱落、血小板活化及血小板血栓形成，易导致心肌梗死、脑梗死等动脉血栓事件。抗血小板治疗可减少心肌梗死、脑梗死等动脉血栓事件，但“药物抵抗”常影响抗血小板治疗疗效。本研究选取具有血栓高危因素(如患有糖尿病、高脂血症、高血压等)或发生过动脉血栓事件(如脑梗死、心肌梗死等)而进行抗血小板治疗的老年患者为研究对象，检测其血小板功能及环氧化酶1(COX-1)、环氧化酶2(COX-2)基因多态性(SNP)，以期为临床抗血小板治疗提供个体化干预指导。

1 对象与方法

1.1 研究对象 选取2011年1月—2012年12月在上海交通大学附属新华医院住院的≥60岁且服用拜阿司匹林1年以上的患者114例，其中具有血栓高危因素者55例(高危组)，发生过动脉血栓事件者59例(血栓组)。高危组中男34例，女21例；年龄60～88岁；糖尿病19例，高脂血症伴高血压36例。血栓组中男36例，女23例；年龄61～85岁；单纯性脑梗死22例、腔隙性脑梗死37例，单纯性脑梗死和腔隙性脑梗死的诊断参照各类脑血管病诊断要点[1]；糖尿病25例，高脂血症伴高血压34例。另选取同期在本院行体检健康者55例为对照组，其中男35例，女20例；年龄60～82岁；均无糖尿病、高脂血症或高血压，且从未服用过拜阿司匹林。3组受试者的性别、年龄具有均衡性。

1.2 方法

1.2.1 血小板计数(PLT)和血小板平均体积(MPV) 采用LH750全自动血液分析仪测定3组受试者PLT和MPV。

1.2.2 血栓弹力图(TEG) 抽取每例受试者空腹静脉血6 ml，其中3 ml用肝素抗凝，3 ml用0.109 mmol/L枸橼酸钠抗凝，在2 h内严格按照说明书进行TEG检查，所用仪器为美国Haemoscope Corp公司TEG-5000血栓弹力仪，测定出血栓最大幅度后再描记30 min后停机；记录血栓最大坚固度(TEG-MA)和花生四烯酸诱导的血小板抑制率(TEG-AA)。前者与血小板质、量和纤维蛋白原水平有关，花生四烯酸(AA)购自Chronolog公司，浓度为0.5 mg/L。TEG-AA≤20%为阿司匹林抵抗(AR)，20%

1.2.3 SNP 抽取每例受试者全血300 μl，按血液Wizard基因组DNA纯化试剂盒(promega公司生产)说明书提取基因组DNA，在260 nm、280 nm紫外分光光度仪下检测DNA吸光度，进行浓度和纯度鉴定；PCR反应引物序列见表1。采用50 μl反应体系进行PCR扩增：DNA模版1.0 μl、上游引物和下游引物各1.0 μl、10 mmol/L dNTP 1.0 μl、去离子水36.3 μl、Taq酶2.5 μl、缓冲液5.0 μl；反应条件：95 ℃预变性3 min，94 ℃ 30 s、55～60 ℃ 35 s、72 ℃ 40～50 s，共35个循环，72 ℃延伸5 min。PCR产物经1%琼脂糖凝胶电泳进行初步鉴定，测序由上海生工生物工程有限公司完成。

表1 PCR反应引物序列Table 1 Primer sequence of PCR

注：COX-1=环氧化酶1，COX-2=环氧化酶2

2 结果

2.1 PLT、MPV和TEG-MA 3组受试者PLT比较，差异无统计学意义(P>0.05)；3组受试者MPV、TEG-MA比较，差异均有统计学意义(P<0.05)，其中血栓组MPV、TEG-MA均大于高危组和对照组，高危组TEG-MA大于对照组，差异均有统计学意义(P<0.05，见表2)。

表2 3组受试者PLT、MPV和TEG-MA比较Table 2 Comparison of PLT，MPV and TEG-MA in the three groups

注：PLT=血小板计数，MPV=血小板平均体积，TEG-MA=血栓最大坚固度；与对照组比较，*P<0.05；与高危组比较，△P<0.05

2.2 TEG-AA 对照组AR 1例、ASR 3例、AS 51例，TEG-AA为(78.7±15.0)%；高危组AR 6例、ASR 12例、AS 37例，TEG-AA为(64.2±23.7)%；血栓组AR 19例、ASR 25例、AS 15例，TEG-AA为(32.5±19.4)%。3组受试者TEG-AA比较，差异有统计学意义(F=86.250，P<0.05)；且血栓组低于高危组，高危组低于对照组，差异均有统计学意义(P<0.05)。

2.3 SNP检测结果

2.3.1 Hardy-Weinberg平衡检验 根据TEG-AA将所有受试者分为NAS组66例和AS组103例，Hardy-Weinberg平衡检验结果显示，NAS组和AS组COX-1基因-1676A>G位点和COX-2基因-765 G>C位点SNP具有群体代表性。PCR扩增产物直接测序结果见图1～2。

2.3.2 COX-1基因-1676A>G位点基因型和等位基因分布 NAS组和AS组COX-1基因-1676A>G位点基因型和等位基因频率比较，差异均有统计学意义(P<0.05，见表3)。

2.3.3 COX-2基因-765G>C位点基因型和等位基因分布 NAS组和AS组COX-2基因-765G>C位点基因型和等位基因频率比较，差异均无统计学意义(P>0.05，见表4)。

注：A为野生型AA基因型，B为杂合子AG基因型，C为突变纯合子GG基因型；颜色加深处为SNP位点

图1 COX-1基因-1676A>G位点PCR扩增产物直接测序结果

Figure1 Directly sequenced result of PCR amplified product of COX-1-1676A>G

注：A为野生型GG基因型，B为杂合子GC基因型；颜色加深处为SNP位点

图2 COX-2基因-765G>C位点PCR扩增产物直接测序结果

Figure2 Directly sequenced result of PCR amplified product of COX-2-765G>C

表3 NAS组和AS组COX-1基因-1676A>G位点基因型和等位基因频率比较〔n(%)〕

Table3 Comparison of genetypes and allele frequency of COX-1-1676A>G between NAS group and AS group

组别例数基因型AA AG GG等位基因A GNAS组6613(19 7)40(60 6)13(19 7) 66(50 0) 66(50 0)AS组10340(38 8)53(51 5)10(9 7)133(64 6)73(35 4)χ2值8 2587 047P值0 0160 008

表4 NAS组和AS组COX-2基因-765G>C位点基因型和等位基因频率比较〔n(%)〕

Table4 Comparison of genetypes and allele frequency of COX-2-765 G>C between NAS group and AS group

组别例数基因型GG CG等位基因G CNAS组6658(87 9)8(12 1)124(93 9)8(6 1)AS组10398(95 1)5(4 9)201(97 6)5(2 4)χ2值2 9922 872P值0 0840 090

3 讨论

老年人血栓形成的几率是儿童和青少年的数百倍至一千倍，早期预防和早期干预尤为重要[3]。老年人容易出现血栓的原因是由于动脉粥样硬化及斑块脱落而造成血管内皮细胞下胶原暴露、血小板活化，最后形成血小板血栓，继而导致心肌梗死、脑梗死等动脉血栓事件[4]。抗血小板药物用于治疗动脉粥样硬化斑块造成的血栓已有几十年的历史，最常用药物为阻断AA途径的阿司匹林。研究表明，阿司匹林用于高危心脑血管疾病患者可分别使动脉血栓事件发生率(心肌梗死或脑梗死)降低25%，冠状动脉旁路移植术及动脉栓塞事件发生率降低48%，肺栓塞发生率降低67%，深静脉血栓形成发生率降低23%[5]。但研究者在实际临床工作中发现，固定剂量的阿司匹林随着用药时间的推移有些个体可出现AR现象，导致“再梗”，且多见于年龄偏大患者[6]。如何预测服用阿司匹林患者是否出现AR及哪些因素容易引起AR是临床医生关注的重要问题。因此，本研究选取具有血栓高危因素或发生过动脉血栓事件而进行抗血小板治疗的老年患者为研究对象，检测其血小板功能及COX-1、COX-2的SNP，以了解AR情况，决定是否需要更改治疗方案，为临床抗血小板治疗提供个体化干预指导。

机体在正常情况下，血管内血小板处于循环状态，但在血栓形成的过程中，由于血管内皮损伤、内皮下胶原纤维暴露而导致流经此处的血小板黏附、聚集、激活，血小板不断消耗，PLT相应地减少，同时血液系统通过反馈机制激活巨核细胞，产生大体积血小板，MPV相应地增大。大体积血小板致密颗粒多、酶活力高、功能活跃、聚集及黏附能力增强，容易导致血栓形成[7]。因此，PLT是反映血小板生成与衰老的指标，MPV是反映巨核细胞增生和血小板生成的指标。TEG-MA是反映PLT和纤维蛋白原相互作用的指标，其中PLT的作用约占80%，因此TEG-MA主要反映血小板的聚集功能[8]。本研究结果显示，3组受试者PLT无明显差异，血栓组MPV、TEG-MA均大于高危组和对照组，高危组TEG-MA大于对照组，提示具有血栓高危因素或发生过动脉血栓事件而进行抗血小板治疗的老年患者巨核细胞被激活，产生了大体积血小板，导致血小板聚集、黏附能力增强。本研究通过计算TEG-AA发现，对照组AR 1例、ASR 3例、AS 51例，TEG-AA为(78.7±15.0)%；高危组AR 6例、ASR 12例、AS 37例，TEG-AA为(64.2±23.7)%；血栓组AR 19例、ASR 25例、AS 15例，TEG-AA为(32.5±19.4)%。血栓组TEG-AA低于高危组，高危组TEG-AA低于对照组。提示具有高危血栓因素或发生过动脉血栓事件而进行抗血小板治疗的老年患者存在AR现象，需要调整抗血小板治疗方案以预防突发性动脉血栓事件，而采用阿司匹林抗血小板治疗仍有发生动脉血栓事件的可能，这部分患者应判为“阿司匹林治疗失败”。心脑血管疾病的发生、发展是多种危险因素共同作用的结果，在血栓形成过程中，血小板活性增强是重要因素，但不是惟一因素，凝血因子的活化也是血液呈高凝状态的重要原因。Kulshrestha等[9]研究表明，脑血管疾病的发生与高血压、糖尿病等密切相关，血小板的数量、质量、形态改变与凝血因子的活化密切相关。

本研究根据TEG-AA将所有受试者分为NAS组66例和AS组103例，探讨老年人COX-1和COX-2的SNP。研究结果显示，NAS组和AS组COX-1基因-1676A>G位点基因型和等位基因频率间均有明显差异，而NAS组和AS组COX-2基因-765G>C位点基因型和等位基因频率均无明显差异。COX-1存在于大多数组织细胞中，是AA转化为前列腺素G和前列腺素H途径的第一个酶，阿司匹林通过使COX-1丝氨酸530位不可逆地乙酰化而阻断血栓素A2(TXA2)的合成，进而发挥抗血栓作用。目前国内外关于COX-1 SNP的研究主要集中于-842A>G、50C>T、22C>T、644C>A位点等。Fan等[10]研究首次证实COX-1基因-1676A>G位点SNP与中国汉族老年人群AR相关，本研究结果与之一致，证明了COX-1基因-1676A>G多位点SNP与老年人AR相关。机体在正常情况下，COX-2只在部分细胞低表达，只有受到炎症等刺激后才会在平滑肌细胞、内皮细胞和血小板中表达增加。阿司匹林对COX-1的抑制作用较COX-2约强170倍，COX-2可能是AR的另一个重要原因[11]。研究表明,COX-2基因-765 G>C位点中携带C等位基因者更易发生AR，AR患者COX-2基因-765G>C位点基因变异率较AS患者明显升高[12-13]，但也有研究表明COX-2基因-765G>C位点SNP与AR无关[14-15]，本研究亦未发现COX-2基因-765G>C位点SNP与AR之间的相关性，分析其原因可能与地区和种族差异有关。

综上所述，血小板活性增强是血栓形成的重要原因，具有高危血栓因素或发生过动脉血栓事件而进行抗血小板治疗的老年患者存在AR现象，需注意调整抗血小板治疗方案；COX-1基因-1676A>G位点SNP可能与AR有关，COX-2基因-765G>C位点SNP可能与AR无关。

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