王俊文，李 俊，蔡 伦，张 涛，王和平，王 雷，陈 文，韩 林

组蛋白去乙酰化酶(histone deacetylases，HDACs)参与细胞信号转导的调控和基因表达，是治疗多种肿瘤性疾病如胶质母细胞瘤的潜在靶点[1-2]，根据其结构特点可分为3类：第Ⅰ类与酵母RPD3同源，包括HDAC1-3及HDAC8；第Ⅱ类与酵母HAD1同源，包括HDAC4-7和HDAC9-11；第Ⅲ类与酵母SIR2同源，命名为SIRT1-7。目前发现Ⅰ类HDACs与肿瘤细胞增殖、分化关系密切，其在多种肿瘤组织中过度表达，如卵巢癌、子宫内膜癌、结直肠癌[2]，但有关Ⅰ类HDACs在星形细胞瘤中表达的研究报道较少，其表达与患者预后间的确切关系尚未明确[3-5]。有研究发现HDAC3可同时在胞核和胞质内表达，其在胞核和胞质内的移位与肿瘤发生、发展密切相关。本研究旨在探讨HDAC3在星形细胞胶质瘤中的表达及其与患者预后的关系。

1 材料与方法

1.1 标本收集 选择华中科技大学同济医学院附属同济医院1996年1月—2008年1月收治的283例原发性星形细胞瘤患者和52例复发患者，均经病理检查证实，WHO分级为Ⅱ～Ⅳ级，其中Ⅱ级59例，Ⅲ级26例，Ⅳ级250例；收集其手术切除标本，提取典型病变区域制作成组织芯片(tissue micro-array，TMA)。本研究获得华中科技大学同济医学院附属同济医院临床试验伦理委员会批准。

1.2 肿瘤细胞培养 采用胰酶消化新鲜肿瘤组织，将消化获得的肿瘤细胞置于37 ℃、5% CO2培养箱内，在含10%胎牛血清培养基(Gibco公司)上培养并传代。

1.4 荧光定量PCR 提取培养细胞RNA，采用紫外分光光度计检测其纯度并定量；取2 μg RNA样本在20 μl反应体系中进行反转录，再取反转录cDNA产物1 μl在20 μl反应体系中进行PCR扩增。HDAC3上、下游引物序列分别为5′-TCTGGGCTGTGATCGATTG- 3′和5′-CTTGACATATTCAACGCATTCC- 3′；以管家基因PITPNB为内参基因，其上、下游引物序列分别为5′- CGAGACTCAGAAAGAACTAGAAACAA-3′和5′- TGACCCTACAGGGGACTCAT-3′。所有引物由Roche公司合成。HDAC3在肿瘤干细胞、胶质瘤贴壁细胞和星形细胞瘤组织中的表达水平采用相对表达量表示，即HDAC3与PITPNB的比值。

1.5 免疫组化染色 在对TMA进行染色之前，采用同型参照抗体在标本上进行同浓度一抗特异性检测，参照抗体购自Acris公司，一抗〔单克隆兔抗人HDAC3(1∶200)〕购自Abcam公司；抗原修复，一抗、二抗孵育及ABC试剂盒显色均按照常规操作流程进行，ABC试剂盒购自Vector Laboratories公司；免疫荧光双染抗体单克隆鼠抗人CD31(1∶100)、单克隆鼠抗人Ki-67(1∶50)、单克隆鼠抗人CD68(1∶100)均购自BD Pharmingen公司，预稀释单克隆鼠抗人GFAP购自Progen公司，ALEXA488抗鼠和ALEXA555抗兔二抗(1∶500)均购自Invitrogen公司。

1.6 TMA染色结果判断标准 由2位高年资研究员分别进行TMA染色结果判断，主要是根据每份标本中阳性细胞所占的百分比进行半定量分级；2位研究员判断结果差异较大时则进行机械计数评估。

1.7 统计学方法 患者总生存期为诊断成立之日到患者死亡之日，随访截止日期为2010-11-30，随访时间为2.6～15.4年，平均为(10.7±4.3)年，其中11例患者中途失访，以最后一次随访时间为研究终点；复发患者、临床资料或随访资料不全患者均不纳入生存周期分析。采用Environment R,Version 2.4.1统计软件(http://www.r-project.org)进行数据分析，绘制Kaplan-Meier曲线，采用Log-rank检验分析HDAC3表达与患者生存率间的关系，以P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 HDAC3表达水平 HDAC3在肿瘤干细胞NCH421k和NCH441中的平均相对表达量为1.14和0.95，在胶质瘤贴壁细胞中为2.04，在星形细胞瘤中为1.06。

2.2 免疫组化染色结果 HDAC3在瘤细胞胞核和胞质中呈阳性表达(见图1～2)。HDAC3胞核总阳性表达率为16.7%(56/335)，其中WHO分级Ⅳ级者为13.6%(34/250)，WHO分级Ⅲ级者为0，WHO分级Ⅱ级者为37.3%(22/59)；HDAC3胞质总阳性表达率为49.3%(165/335)，其中WHO分级Ⅳ级者为42.0%(105/250)，WHO分级Ⅲ级者为65.4%(17/26)，WHO分级Ⅱ级者为72.9%(43/59)。

图1 HDAC3在WHO分级Ⅱ～Ⅳ级星形细胞瘤中的表达(免疫组化染色，×20，内插×40)

Figure1 Expression of HDAC3 in astrocytic tumors with WHO stageⅡ to Ⅳ

注：A为CD31染色对比，B为CD68染色对比，C为GFAP染色对比

图2 HDAC3在星形胶质瘤、内皮细胞、小胶质细胞中的表达(免疫双荧光染色，×40)

Figure2 Expression of HDAC3 in astrocytic tumors,endothelial cells and microglia cells

2.3 HDAC3在复发患者中的表达 52例复发患者中23例两次TMA保存完整，可进行对比观察，其中5例WHO分级恶化，18例WHO分级无恶化。5例WHO分级恶化患者中，HDAC3胞核染色强度减弱2例，稳定2例，增强1例；胞质染色强度稳定4例，增强1例。18例WHO分级无恶化患者中，HDAC3胞核染色强度减弱2例，稳定13例，增强3例；胞质染色强度减弱4例，稳定9例，增强5例。

2.4 HDAC3表达与患者生存率的关系 HDAC3胞核阳性表达率与患者整体生存率呈正相关(r=0.148，P=0.007，见图3A)，阳性表达强度与WHO分级Ⅳ级患者生存率呈负相关(r=-0.503，P=0.037，见图3B)；HDAC3胞质阳性表达强度与患者整体生存率呈负相关(r=-0.140，P=0.014，见图4A)，阳性表达率与WHO分级Ⅳ级患者生存率呈负相关(r=-0.544，P=0.013，见图4B)。

注：A为WHO分级Ⅱ～Ⅳ级患者，n=283；B为WHO分级Ⅳ级患者，n=250

图3 HDAC3在胞核中的表达与星形细胞瘤患者生存率间的关系(Kaplan-Meier曲线)

Figure3 Correlation between nuclear expression of HDAC3 and survival rate of patients with astrocytic tumors

注：A为WHO分级Ⅱ～Ⅳ级患者，n=283；B为WHO分级Ⅳ级患者，n=250

图4 HDAC3在胞质中的表达与星形细胞瘤患者生存率间的关系(Kaplan-Meier曲线)

Figure4 Correlation between cytoplasmic expression of HDAC3 and survival rate of patients with astrocytic tumors

3 讨论

HDAC3属I类HDACs，其克隆序列与HDAC1及HDAC2类似[6]。HDAC3与HDAC1在DNA序列上有50%相同，在蛋白质序列上有53%相同；HDAC3与HDAC2在DNA序列上有51%相同，在蛋白质序列上有52%相同。但与HDAC1和HDAC2不同的是，HDAC3缺少前两者共有的氨基端及羧基端结构，可在胞核和胞质内表达并具有免疫活性[7]，而前两者只局限在胞核内表达。此外，HDAC3还具有核定位信号(NES)和核输出信号(NLS)，其共同决定了HDAC3在细胞内的分布[8]。Bhaskara等[9]研究发现，HDAC3与鼠胚胎干细胞的分化相关，HDAC3缺失可导致第9.5天时胚胎死亡，原因为细胞分化缺陷；HDAC3还可以延长细胞周期，修复DNA损伤，敲除HDAC3基因后胚胎纤维原细胞凋亡增加。Escaffit等[10]研究发现，灭活鸡或哺乳动物体内HDAC3过度表达将导致细胞凋亡的发生。Liby等[11]研究发现，HDAC3在正常胶质细胞及非恶性增生角质细胞内呈一致的胞核/胞质弱染色，在高级别胶质瘤细胞内则呈现明显的强染色，且主要为胞质强染色。

本研究结果显示，HDAC3在肿瘤干细胞NCH421k和NCH441中的平均相对表达量为1.14和0.95，在胶质瘤贴壁细胞中为2.04，在星形细胞瘤中为1.06，介于肿瘤干细胞和胶质瘤贴壁细胞之间；在胞核和胞质呈阳性表达，其中胞核总阳性表达率为16.7%，胞质总阳性表达率为49.3%，在复发患者中，HDAC3表达基本稳定或减弱；通过绘制Kaplan-Meier曲线发现，胞核或胞质HDAC3的表达与患者WHO分级相关。由于HDAC3自身具备的特点，其可以在胞核及胞质内同时存在或发生移位，Liby等[11]研究也发现HDAC3在非恶性胶质细胞核表达。既往研究显示，HDAC3在胞核的表达与胃癌、肾癌、结直肠癌患者生存周期无关，本研究结果与之不一致，提示HDAC3在星形细胞瘤中的作用与其在其他肿瘤中的作用不同，HDAC3在胞核中的高表达预示着星形细胞瘤患者预后更好。

通常情况下，胞质内HDAC3与IκBα/NF-κB构成静默复合体，可有效抑制NF-κB和HDAC3的功能，而一旦被激活，IκBα将发生磷酸化并被蛋白酶体降解，HDAC3-NF-κB/IκBα静默复合体解体，HDAC3和NF-κB便可转移入细胞核内而发挥调节作用。NF-κB进入细胞核后，可结合于NF-κB增强子区并募集组蛋白乙酰化酶p300/PCAF乙酰化组蛋白疏松染色体结构，进而启动一系列靶基因转录过程，如NF-κB负反馈抑制蛋白IκBα转录、新合成的IκBα结合NF-κB并中止其促转录等。NF-κB募集的组蛋白乙酰化酶p300/PCAF在乙酰化组蛋白的同时也乙酰化了NF-κB亚单位RelA(p65)，以稳固RelA(p65)与DNA的结合，削弱RelA(p65)与IκBα的结合，从而保证下游基因的转录；而HDAC3则能够使RelA(p65)去乙酰化，促进其解离DNA并中止相关转录过程。有研究发现NF-κB在很多肿瘤中过度激活，对细胞增殖和凋亡相关蛋白表达的调节失控，过度激活的NF-κB可增强促瘤生长相关蛋白如Bcl-2、Sox2等的表达，减少抑制瘤生长相关蛋白如Bax、PPARγ等的表达。

Escaffit等[10]研究发现，HDAC3具有抗细胞凋亡的作用，稳定的核内HDAC3表达不仅可抑制半胱氨酸介导的聚二磷酸腺苷核糖多聚酶(PARP)的降解，还能抑制NKG2D自然杀伤细胞及配体ULBPs在上皮细胞肿瘤中的表达，而这两者可引起自然杀伤细胞及T细胞介导的宿主免疫反应，导致免疫识别及消除[12]。在核内，HDAC3可以与视网膜母细胞瘤蛋白(Rb蛋白)及过氧化酶体增殖物激活受体γ(PPARγ)结合形成三元复合体，这种三元复合体可以抑制PPARγ的活性，并在激活的分化期内保持细胞稳定。当感应到凋亡信号时，胞核内的HDAC3被游离并转移入胞质，从而不再造成凋亡启动子上的组蛋白去乙酰化，发挥抗凋亡作用。除了导致组蛋白去乙酰化外，HDAC3亦可与其他蛋白直接作用[13]，可通过导致Re1A去乙酰化直接抑制某些转录因子如GATA-2、YY1及TFII-I等的表达[14-15]。

综上所述，HDAC3在胞核和胞质的双重表达及移位对星形细胞瘤的生物学特质具有重要的调节作用，有效调控HDAC3在胞核的表达对抑制星形细胞瘤进展具有潜在应用价值。

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