王春明，郭建国，漆永红，吕和平，杜蕙，刘长远

（1.甘肃省农业科学院植物保护研究所，甘肃兰州730070；2.辽宁省农业科学院植物保护研究所，辽宁沈阳 110161）

葡萄内生细菌菌株Zyx-3生理生化特性及抑菌能力测定

王春明1，郭建国1，漆永红1，吕和平1，杜蕙1，刘长远2

（1.甘肃省农业科学院植物保护研究所，甘肃兰州730070；2.辽宁省农业科学院植物保护研究所，辽宁沈阳 110161）

以分离自葡萄叶片内生细菌菌株Zyx-3为研究对象，依据其形态特征、生理生化特性等初步确定了其分类地位，并采用平板对峙法测定了其对14种植物病原真菌的抑菌能力。结果表明，Zyx-3菌体杆状，中生芽孢，革兰氏染色阳性；菌株具有运动性和需氧性，可以使明胶液化、淀粉水解，接触酶反应阳性，具有耐盐性，可在10%NaCl培养液中生长。根据其形态特征及生理生化特性，初步确定其为芽孢杆菌（Bacillus spp.）。该菌株对玉米大斑病菌（Exserohilum turcicum）、辣椒炭疽病菌（Colletotrichum capsici）、苹果腐烂病菌（Valsa mali）、马铃薯立枯丝核病菌（Rhizoefonia solani）、半夏早疫病菌（Alternaria sonali）、苹果轮纹病菌（Physalospora piricola）、葡萄灰霉病菌（Botrytis cinerea）和葡萄白腐病菌（Coniothyrium diplodiella）、茄子菌核病菌（Sclerotinia sclerotiorum）等14种供试植物病原真菌均有不同程度的抑制作用，抑菌谱广。

内生细菌；形态特征；生理生化特性；拮抗作用

目前，化学农药的使用对农作物病虫害的防治起到了重要作用。但是，长期大量使用化学农药，不仅对土壤、大气和水体等环境造成严重污染，对人、畜健康造成危害，还导致病虫抗药性上升，防治效果逐步降低，防治难度增加，而利用微生物进行病虫害的防治和农药残留的清除是一种无公害、无二次污染的高新技术，是微生物学研究的一个热点［1～3］。

植物体是一个复杂的微生态系统，几乎所有健康植物体内均含有内生细菌。这些内生细菌不仅将植物作为其栖息场所，而且对寄主植物有促生、防病、内生固氮等多方面的生物学作用。同时，植物内生细菌还是良好的外源基因载体，为抗病杀虫及固氮等植物外源基因向植物体内的转移提供了一种新的方法和途径。许多学者认为，内生细菌是植物病害生物防治的天然资源菌，具有广阔的理论研究价值和开发应用前景［4］。中国具有丰富的微生物资源，其中存在大量可开发利用的优良菌株，但由于植物内生细菌定殖于植物内部的细胞间隙中，且同一植株不同部位内生细菌的种类和功效也可能不同，因而给内生细菌的研究带来一定的困难。许多学者已从棉花、玉米、小麦、油菜、马铃薯、辣椒等多种植物体中分离获得内生拮抗细菌，这些内生拮抗细菌对多种植物病害具有较好的防治效果，合理利用可以减轻化学药剂造成的环境污染，有利于保持生态平衡［5～9］。目前，对果树内生细菌的分离、筛选及其分类鉴定地位的研究较少。我们对葡萄叶片内生微生物区系中分离获得的内生细菌菌株Zyx-3的抑菌能力、形态、生理生化特性等进行了研究，初步确定其分类地位，以期为开发经济环保的生物农药提供菌种资源，为果树植物内生拮抗菌的开发和利用提供依据。

1 材料与方法

1.1 材料

供试内生细菌菌株Zyx-3于2012年9月分离自葡萄品种醉人香叶片。指示植物病原真菌名称及编号见表1，均由甘肃省农业科学院植物保护研究所植物病害研究室提供。

表1 供试植物病原真菌

1.2 方法

1.2.1 菌株形态学观察将内生细菌菌株Zyx-3在PDA平板上培养24 h，用显微镜观察其菌体形态和芽孢等重要特征，利用革兰氏染色等方法进行鉴定。

1.2.2 培养特性观察取菌龄24～48 h的Zyx-3菌株，分别接种在PDA（去皮马铃薯200 g，葡萄糖20 g，琼脂12 g，自来水1 000 mL，自然pH）平板、PDA斜面、NA培养液（牛肉膏3 g，酵母浸膏1 g，蛋白胨5 g，葡萄糖10 g，琼脂12 g，自来水1 000 mL，pH 7.2）中，28 ℃下培养24 h，观察其生长特性。

1.2.3 生理生化特性测定参照方中达《植物病理研究方法》和乔宏萍等的研究方法［10］，对Zyx-3菌株进行需氧性和运动性、明胶液化、淀粉水解、柠檬酸盐利用，以及纤维素水解、甲基红试验、H2S产生、接触酶和耐盐性测定。

1.2.4 内生细菌Zyx-3抗真菌谱的测定将表1中的14种植物病原真菌作为指示菌，在培养皿（直径90 mm）中倒入15 mL PDA培养基，取指示菌菌落边缘的菌丝块（直径5 mm）放在倒好的PDA平板中央，在培养皿背面距指示菌25 mm标记4点，分别在这4点点接在NA培养基上经活化培养48 h的内生细菌Zyx-3菌株，以不点接内生细菌Zyx-3菌株为对照，置于28 ℃下培养，每处理3个重复。培养5 d后观察Zyx-3菌株在平板上的抑菌现象，测量抑菌带的宽度（即内生细菌落边缘到供试病原真菌菌落边缘的距离）。

2 结果与分析

2.1 菌株形态特征

经过革兰氏染色、显微镜观察可见，内生细菌Zyx-3菌体呈杆状，革兰氏染色为阳性，芽孢着生于菌体的中间，呈柱形或者椭圆形（图1）。

图1 内生细菌Zyx-3的形态

2.2 菌株培养特性

内生细菌Zyx-3在PDA平板上生长的菌落呈圆形，表面凸起，后产生皱褶，表面无光泽，不光滑。在PDA斜面上划线培养生长良好，边缘整齐，无光泽。在澄清的NA培养液中生长良好，在培养液表面形成褶皱的膜层，生长物聚在膜下，液体不浑浊。

2.3 生理生化测定结果

对内生细菌Zyx-3进行生理生化测定的结果表明，菌株需氧性和运动性呈现阳性；可以使明胶液化；水解淀粉周围不变色，为阳性反应；不能利用柠檬酸盐；不能水解纤维素；不产生H2S；过氧化氢酶反应为阳性；具有耐盐性，可以在10% NaCl培养液中生长；甲基红试验结果颜色为黄色，呈阴性反应。

2.4 抑菌能力

由对峙培养5 d的结果（图2）可见，内生细菌Zyx-3具有较广的抗真菌谱，14种供试病原真菌的生长不同程度地受到菌株Zyx-3的抑制，抑菌带在4.2～11.5 mm。其中Zyx-3对玉米大斑病菌（Exserohilum turcicum）和半夏早疫病菌（Alternaria sonali）的抑制效果最强，抑菌带分别达11.5 mm和11.1 mm；对马铃薯立枯丝核病菌（Rhizoefonia solani）、苹果腐烂病菌（Valsa mali）、辣椒炭疽病菌（Colletotrichum capsici）、葡萄灰霉病菌（Botrytis cinerea）、茄子菌核病菌（Sclerotinia sclerotiorum）的抑制效果较强，抑菌带宽度在8 mm以上；对番瓜绵腐病菌（Pythiun aphanidermatua）的抑制效果最弱，但抑菌带也在4 mm以上。且在28 ℃条件下黑暗培养，苹果腐烂病菌（Valsa mali）、西瓜蔓枯病菌（Mycosphaerellam elonis）、马铃薯立枯丝核病菌（Rhizoefonia solani）、茄子菌核病菌（Sclerotinia sclerotiorum）、葡萄灰霉病菌（Botrytis cinerea）培养5 d的对照组已长满皿，棉花枯萎病菌（Fusarium oxysporum f. sp.vesinfectum）和西葫芦绵腐病菌（Pythiun aphanidermatua）培养6 d的对照组长满皿，苹果轮纹病菌（Physalospora piricola）、辣椒疫霉病菌（Phytophthora capsici Leonian）和黄瓜枯萎病菌（Fusarium oxysporum f. sp. Cucumerinum）培养7 d的对照组长满皿，玉米大斑病菌（Exserohilum turcicum）、葡萄白腐病菌（Coniothyrium diplodiella）培养8 d的对照组长满皿，辣椒炭疽病菌（Colletotrichum capsici）培养10 d的对照组长满皿，而半夏早疫病菌（Alternaria sonali）培养14 d的对照组未长满皿。当对照均长满皿时，内生细菌Zyx-3对14种供试的植物病原真菌抑菌带仍在4.1～11.0 mm，其中对玉米大斑病菌（Exserohilum turcicum）和半夏早疫病菌（Alternaria sonali）的抑制带宽度仍保持在9 mm以上。

图2 对峙培养5 d后内生细菌Zyx-3与供试植物病原真菌之间的抑制效果

3 小结与讨论

1）从葡萄叶片中分离到的内生细菌Zyx-3菌体呈杆状，革兰氏染色为阳性，芽孢着生于菌体的中间，呈柱形或者椭圆形，且菌株具有运动性和需氧性，可以使明胶液化；可以使淀粉水解；过氧化氢酶反应阳性，具有耐盐性，可在10% NaCl培养液中生长。菌体杆状，中生芽孢，革兰氏染色阳性。Zyx-3对14种指示植物病原真菌的生长均具有明显的抑制作用，其中对玉米大斑病菌（Exserohilum turcicum）和半夏早疫病菌（Alternaria sonali）的抑制效果最强，对马铃薯立枯丝核病菌（Rhizoefonia solani）、苹果腐烂病菌（Valsa mali）、辣椒炭疽病菌（Colletotrichum capsici）、葡萄灰霉病菌（Botrytis cinerea）、茄子菌核病菌（Sclerotinia sclerotiorum）的抑制效果较强。

2）细菌因庞大的种群、高繁殖力等特点而易于人工培养，在自然发生的生物防治和人类应用生物防治的活动中，拮抗细菌及其代谢产物都起到了重要作用。目前，应用较多的生防细菌主要有芽孢杆菌（Bacillus spp.）、假单胞杆菌（Pseudomonas spp.）、土壤放射杆菌（Agrobacterium radiobacter）等［11］。而芽孢杆菌（Bacillus spp.）是目前生防细菌中研究较多的一类，因其能够产生耐热、耐旱、抗紫外线和有机溶剂的内生孢子，所以是理想的生防菌筛选对象［12～13］。芽孢杆菌的抑菌范围也很广，包括根部病害、枝干病害、叶、花部病害和收获后果品病害［14］。已报道的生防芽孢杆菌有枯草芽孢杆菌（B.subtilis）、蜡状芽孢杆菌（B.cereus）、多粘芽孢杆菌（B.polymyxa）、巨大芽孢杆菌（B.megaterium）、短小芽孢杆菌（B.pumilus）等［15］。根据东秀珠等的《常见细菌系统鉴定手册》描述，初步确定葡萄内生细菌Zyx-3菌株为芽孢杆菌（Bacillus spp.）［16］。该芽孢杆菌具有较广的抗真菌谱，为葡萄真菌病害和其他真菌病害的生物防治提供了新的微生物资源，是一种具有潜在应用前景的生防菌株。但其产生抗菌物质、生防作用是否稳定，在田间的定植能力、适应性、稳定性以及田间防治效果还有待于进一步研究。

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（本文责编：王建连）

Physiological and Biochemical Characteristics of Endophytic Bacteria Strains of Zyx-3 in Grape Leaves and Its Antibacterial Ability Determination

WANG Chun-ming1，GUO Jian-guo1，QI Yong-hong1，LV He-ping1，DU Hui1，LIU Chang-yuan2
（1. Institute of plant protection，Gansu Academy of Agricultural Sciences，Lanzhou Gansu 730070，China；2. Institute of plant protection，Liaoning Academy of Agricultural Sciences，Shenyang Liaoning 110161，China）

The strain Zyx-3 was isolated from grape leaves endophytic bacteria as research object，on the basis of their morphological characteristics，physiological and biochemical characteristics were confirmed its classification status，and the 14 kinds of plant pathogenic fungi inhibitory ability were determined by plate confrontation method.The results shows that the strain Zyx-3 are also rod-shaped，grown in the middle at the end the character of movement quality and aerobic，can make the gelatin liquefaction，starch hydrolysis，contact enzyme reaction is positive，with salt tolerance，can be cultured in the culture medium 10% NaCl.According to its morphological，physiological and biochemical characteristics of cell，initially identified as Bacillus（Bacillus spp.）.For 14 kinds of plant pathogenic fungi tested，their have inhibition of different degree，Broad spectrum antimicrobial which the strain of Exserohilum turcimali，Colletotrichum capsici，Valsa mali，Rhizoefonia solani；Alternaria sonali；Physalospora piricola，Botrytis cinerea and Coniothyrium diplodiella，Sclerotinia sclerotiorum.

Endophytic bacteria；Morphology；Physiological and biochemical characteristics；Antagonism

S182；S663.1

A

1001-1463（2014）10-0007-04

10.3969/j.issn.1001-1463.2014.10.003

2014-06-16

公益性行业（农业）科研专项资助项目（201203035）、甘肃省科技支撑计划项目（1204NKCA099）、甘肃省农业科学院青年基金项目（2013GAAS35）部分内容

王春明（1979—），女，甘肃武威人，助理研究员，主要从事农作物病害研究工作。联系电话：（0931）7617133。E-mail：wchm179@163.com

杜蕙（1970—），女，甘肃临洮人，副研究员，主要从事农作物病害研究工作。联系电话：（0931）7651179。E-mail:dh0928@163.com