赵 光 李 珺* 杜雪静

液相色谱-质谱联用法分析木瓜中绿原酸与抗癌活性成分的相关性研究*

赵 光①李 珺①*杜雪静①

目的：高效液相色谱-质谱联用法(HPLC-MS)分析木瓜中绿原酸与抗癌活性成分的相关性。方法：采用HPLC-MS联用法，在Diamonsil C18色谱柱(4.6 mm×250 mm，5 μm)，乙腈-0.05%磷酸水溶液梯度洗脱；流速为0.8 ml/min；检测波长为325 nm；柱温为25 ℃。分离测定木瓜中绿原酸的含量。结果：木瓜中绿原酸的含量为1.3 mg/g，相对标准偏差(RSD)为0.4%，线性关系良好。结论：木瓜中含有绿原酸，其主要成分与木瓜对脂肪酸合酶(FAS)的抑制及抗肿瘤作用有潜在的相关性。

木瓜；高效液相色谱-质谱；绿原酸

赵光，女，(1961- )，硕士，副教授。首都医科大学化学生物学与药学院，从事医药化学教学与天然药物科研工作。

木瓜(Chaenomeles speciosa sweet nakai)为蔷薇科植物贴梗海棠的干燥近成熟果实，习称“皱皮木瓜”，主产于我国安徽、山东、浙江、河南、湖北及西南地区[1]。木瓜有舒筋、活络、健脾开胃、舒肝止痛及祛风除湿等功效，临床可用于预防和治疗风湿病、霍乱、痢疾、肠炎、脚气病及维生素C缺乏症等。研究表明，木瓜提取物有抗菌、镇痛、抗炎、免疫调节、抗氧化和抗肿瘤等新的活性[2-3]。

木瓜的营养成分非常丰富，含有糖类、蛋白质及氨基酸类、脂质及脂肪酸类、有机酸类、水溶性维生素和果胶等[4-5]。其生理活性物质包括甾醇类化合物、萜类化合物、黄酮类化合物、鞣质和多酚等[6-7]。木瓜籽含有脂肪酸、维生素及微量元素等，具有抗氧化、抗肿瘤活性[8-9]。木瓜果实主要包含黄酮类、有机酸类、三萜类、皂苷类、糖类和鞣质等。其中有机酸类主要有咖啡酸、绿原酸和苹果酸等。而绿原酸是许多植物中抗菌消炎、清热解毒的活性成分，具有清除自由基、抗脂质过氧化、抗菌和抗病毒等作用[10]。

木瓜被国家卫生部首批认定为药食同源品种之一，而皱皮木瓜是药用木瓜的正品[11]。其种子、枝叶及花均可入药，可作为绿色保健食品或药品开发。以往对于木瓜营养成分及其提取工艺的研究比较多，而结合其独特的活性成分进行分离分析的报道较少[12-13]。本研究在前期工作中对木瓜的抑制脂肪酸合酶及抗癌活性进行了初步研究，表明木瓜对脂肪酸合酶(fatty acid synthase，FAS)具有很高的抑制活性[14]。为进一步明确木瓜的活性物质基础，并对其中的主要化学成分进行分离分析，研究木瓜中各种有效成分的合理应用，对木瓜中有效成分的含量进行测定，为其作用机制及药理作用的后续研究打好基础。本研究应用高效液相色谱-质谱联用法(HPLC-MS)对木瓜果实的主要成分及其含量进行测定。

1 材料及方法

1.1 仪器与试剂

采用Agilent 1100 series高效液相色谱仪，Diamonsil C18色谱柱，KQ-500型超声波清洗器，1000 ml过滤器，Quattro micro TM API质谱仪。

绿原酸标准品(中国药品生物制品检定所)，乙腈(色谱纯，Fisher)，磷酸(分析纯，北京世纪红星化工有限责任公司)，木瓜粉末(同仁堂)，二蒸水。

1.2 样品制备

(1)对照品配置。精密称取咖啡酸3.2 mg溶于甲醇，定容于10 ml容量瓶，备用。

(2)供试品配置。精密称取木瓜粉末1.0925 g，溶于50 ml甲醇，超声45 min，补足失去的甲醇，即得储备液，备用。

1.3 色谱条件

试剂为乙腈、水和磷酸；流动相A为乙腈，流动相B为0.05%磷酸水溶液；梯度洗脱，其程序见表1；流速为0.8 ml/min；进样量为10 ul；检测波长为325 nm。

表1 流动相梯度洗脱程序

1.4 质谱条件

选用电喷雾(ESI)离子源，在负离子电力模式下采用全扫描的方式，绿原酸的母离子是m/z353.3。质谱参数：脱溶剂气(N2)流速为350 L/h，锥孔气(N2)流速为50 L/h，脱溶剂气温度为200 ℃，源温度为120 ℃，锥孔电压为10V，毛细管电压为3.5 kV。

2 结果与分析

2.1 定性分析

在选定的色谱条件下，保留时间为19.64 min，测得标准品和样品的色谱图如图1所示，绿原酸标准品质谱如图2所示。

图1 色谱图

2.2 线性关系

分别用甲醇稀释各对照品储备液，取绿原酸浓度为(3.2×10-3)～(6.4×10-2)mg/ml，按上述色谱条件测定峰面积，以相应组分峰面积Y对其进样浓度X (mg/ml)进行线性回归。得线性方程为：Y=37038X＋18.345(r=0.9993)。在(3.2×10-3)～(6.4×10-2) mg/ml线性关系良好，检测限为(0.4×10-3)mg/ml。

2.3 精密度

取样品溶液重复进样，将质量浓度为(3.2×10-3) mg/ml的绿原酸标准品溶液分别测定5次，计算相对标准偏差(relative standard deviation，RSD)(精密度)为3.1%，表明绿原酸在样品中较为稳定。

2.4 回收率

取木瓜储备液100 ul，加入50 ul绿原酸标准品溶液(0.5×10-2)mg/ml，计算绿原酸回收率为94.1%(测定5次)。

图2 绿原酸标准品质谱图

2.5 样品含量测定

取木瓜储备液在同样色谱条件下进行3次测定，记录峰面积，代入回归方程计算含量。测得木瓜中绿原酸含量为1.3 mg/g，RSD＝0.4%。

3 讨论

本研究测定结果表明，木瓜中绿原酸含量为1.3 mg/g，RSD＝0.4%；所建立的绿原酸含量测定方法准确可靠、重复性好、回收率高，适用于木瓜的质量分析。运用本方法测定木瓜中绿原酸较为稳定。

通过实验发现，木瓜对脂肪酸合酶有较高的抑制活性，而木瓜中含有较多的绿原酸。绿原酸是一种缩酚酸，属酚类化合物，对抑制突变及抗肿瘤、清除体内自由基、抗氧化、保肝利胆以及抗菌抗病毒等有广泛的生物活性[15]。FAS在癌细胞组织中高表达，而木瓜中高含量的绿原酸，可能与其抑制FAS有相关性，有潜在的抑制肿瘤的作用。

对于相关的应用标准中无含量测定方法，不利于制剂的质量控制[16]。并且植物药中的组成复杂，在不能测定全部活性成分时可以测定其中主要活性成分，作为品种的质量控制和评价模式。木瓜具有良好的开发前景，通过国内外专家的不断深入研究探索，利用现代的医学分离分析装备，建立以高效液相色谱-质谱法测定木瓜中绿原酸含量的方法进行研究和质量评价，将会发挥更大的作用。

[1]谢海伟，文冰.木瓜药理成分及产品开发研究进展[J].生命科学研究，2012，16(1)：79-84.

[2]Du H，Wu J，Li H，et al.Polyphenols and triterpenes from Chaenomeles fruits：Chemical analysis and antioxidant activities assessment[J]. Food chemistry，2013，141(4)：4260-4268.

[3]Yao GD，Liu CQ，Huo HQ，et al.Ethanol extract of Chaenomeles speciosa Nakai induces apoptosis in cancer cells and suppresses tumor growth in mice[J].Oncol Lett，2013，6(1)：256-260.

[4]杨沫，吴茜，程菁菁，等.宣木瓜总三萜、齐墩果酸和熊果酸含量测定[J].安徽中医学院学报，2013，32(4)：83-86.

[5]Zhu Q，Liao C，Liu Y，et al.Ethanolic extract and water-soluble polysaccharide from Chaenomeles speciosa fruit modulate lipopolysaccharideinduced nitric oxide production in RAW 264.7 macrophage cells[J].Journal of Ethnopharmacolo gy，2012(144)：441-447.

[6]谢海伟，张斌，杨贤松，等.宣木瓜有效成分的研究进展[J].中药材，2012，35(1)：157-161.

[7]Huang G，Xi Z，Li J，et al.Isolation of two new phenolic compounds from the fruit of Chaenomeles speciosa(Sweet)Nakai[J].Phytochemistry Letters，2013，6(4)：526-530.

[8]王梦倩，蔡圣宝，籍保平.皱皮木瓜籽的抗氧化活性以及对HepG2细胞的生长抑制作用[J].食品科技，2013(2)：207-210.

[9]李莉，陈正伟，宋聚学.野木瓜籽油化学成分分析及急性毒性评估[J].贵州农业科学，2013(5)：58-60.

[10]胡仲秋，洪小迪，岳田利.光皮木瓜绿原酸的提取及抗菌活性测定[J].食品科学，2010(24)：8-13.

[11]肖硕，丁卓伶.木瓜活性成分提取工艺研究进展[J].湖北农业科学，2012，51(5)：877-879.

[12]蒋顶云，蒋长兴，熊清平，等.皱皮木瓜中齐墩果酸的超临界CO2提取工艺优选[J].中国实验方剂学杂志，2012，18(17)：20-24.

[13]陈翠，熊德琴，李春晖.木瓜中总黄酮提取最佳工艺的研究[J].广东石油化工学院学报，2012(1)：15-17.

[14]赵光，李珺，元华龙，等.天然产物中脂肪酸合酶抑制剂的筛选[J].中国民族民间医药，2009，18(20)：2-3.

[15]聂雪凌，唐鸿志，许平.绿原酸的检测及代谢途径研究进展[J].广州化工，2013，41(1)：3-6.

[16]李霞，杨颖博，李君丽，等.HPLC法同时测定皱皮木瓜中原儿茶酸和绿原酸的含量[J].中国医药导报，2012，9(34)：110-112.

Analysis on chlorogenic acid of chaenomeles speciosa and its correlations with anticancer by high performance liquid chromatography-mass spectrometry

ZHAO Guang, LI Jun,DU Xue-jing// China Medical Equipment,2014,11(5):4-6.

Objective:To analyze chlorogenic acid of Chaenomeles speciosa by high performance liquid chromatography-mass spectrometry.Methods:A method for determining chlorogenic acid of Chaenomeles speciosa by HPLC-MS is described. The operating conditions were Diamonsil C18column (5 μm, 4.6×250 mm) at room temperature, acetonitrile-0.05% phosphoric acid solution as mobile phase by step gradients elution at a flow of 0.8 ml/min and UV detection at 325 nm.Results:The content of chlorogenic acid of Chaenomeles speciosa is 1.3 mg/g (RSD 0.4%), respectively.Conclusion:Chlorogenic acid was detected from Chaenomeles speciosa, which may be related to its inhibition of FAS and the potential role of anticancer.

Chaenomeles speciosa; HPLC-MS; Chlorogenic acid

1672-8270(2014)05-0004-03

R284.1

A

10.3969/J.ISSN.1672-8270.2014.05.002

2013-11-20

国家自然科学基金(30500648)“以FAS为靶从元宝枫发展无耐药性的抗肿瘤药物”；北京市自然科学基金资助(7103168)“以介孔材料为载体从天然产物发展抗肿瘤靶向给药系统”；北京市教育委员会科技发展计划面上项目(KM201010025011)“从虎杖等天然产物中发展肿瘤化学预防药物”；首都中医药研究专项(ZM02)“医院制剂抗瘤丸治疗神经胶质瘤的作用机理研究”

①首都医科大学化学生物学与药学院 北京 100069

*通讯作者：lijun88@ccmu.edu.cn

[First-author’s address]School of Chemical Biology and Phamaceutical Sciences, Capital Medical University, Beijing 100069, China.