刘 松，闪 旭

（新疆旭日环保股份有限公司，乌鲁木齐 830000）

活性污泥是活性污泥法处理污水系统的功能主体。20世纪80年代之前，活性污泥菌群的研究主要以传统的分离培养法为主，但培养的细菌数量只占活性污泥微生物总数的1%～15%。20世纪80年代后期，随着以16SrRNA为主要基石的细菌分子分类学的发展，PCR技术、电泳技术、克隆文库技术、荧光原位杂交（FISH）和流式细胞术（FCM）等免培养的分子生物学技术逐渐成为研究活性污泥菌群的主要手段，活性污泥中菌群的复杂性和多样性也以惊人的速度被人们认识，大量传统检测方法未能发现却在活性污泥中起关键作用的微生物陆续被发现。为了深入了解免培养法发现的大量新的菌群的生理特性和作用机制，20世纪90年代后期，许多模拟活性污泥菌群生存环境的现代培养技术开始发展，且已成功培养了一部分传统分离培养技术不能培养的新培养物，这无疑将把人们对活性污泥菌群的研究推向一个新的层次。

1 活性污泥法概述

1.1 活性污泥及活性污泥法

活性污泥是微生物群体及它们所依附的有机物质和无机物质的总称。污水处理中，大多采用活性污泥法，而这种方法是通过微生物降解污水中的有机物质，使污水得到净化，是当前使用最广泛的一种生物处理法。活性污泥法是将空气连续鼓入曝气池的污水中，经过一段时间，水中即形成繁殖有巨量好氧微生物的絮凝体，即活性污泥，它吸附水中的有机物，生活在其上的微生物以有机物为食料，获得能量并不断生长增殖，有机物被去除，污水得到净化。它不仅适用于生活污水的处理，且在纺织、印染、炼油、石油化工、造纸、焦化等许多工业废水处理中，都取得了较好的净化效果。

1.2 活性污泥法原理

活性污泥法是以活性污泥为主体的污水生物处理技术。其原理是通过充分曝气供氧，使大量繁殖的生物群体悬浮在水中并利用从而降解污水中的有机污染物；停止曝气时，悬浮微生物絮凝体易于沉淀与水分离，并使污水得到净化、澄清。这种具有活性的絮凝体就是被称为“活性污泥”的生物污泥。因此，要对污水生物处理技术作进一步研究，就必须深入了解活性污泥内部的结构原理。

2 活性污泥中的微生物菌群

活性污泥是由细菌、微型动物为主的微生物与悬浮物质、胶体物质混杂在一起所形成的茶褐色的絮凝体。其中的微生物主要由细菌组成，细菌主要有菌胶团细菌和丝状菌，数量可占污泥中微生物总量的90%～95%，细菌在有机废水的处理中起着最重要的作用。此外，活性污泥中还有原生动物和后生动物等微型动物。在处理生活污水的活性污泥中存在大量的原生动物和部分微型后生动物，通过辨别认定其种属，据此可以判别处理水质的优劣，因此将微型动物称为活性污泥系统中的指示生物。

活性污泥中微生物菌群具有高度多样性，可分为6个主要的类群，其中，拟杆菌（Bacteroides）类群和γ变形菌（γ-Proteobacteria）类群所占比例最大，分别为38.03%和32.39%：其次是β- Proteobacteria，占19.72%；Firmicutes，Candidate division TM7和α-Proteobacteria类群所占比例相对较小，分别为4.23%，4.23%和1.04%。

2.1 动胶杆菌属

动胶杆菌属的典型特征是能形成菌胶团，而菌胶团是活性污泥的重要结构。 本属的大多数菌种能够产生高絮凝活性，能够与有机物结合成絮状，使重金属离 子、P元素沉淀，使水体净化，并且在最近的污水处理研究中也占有重要的地位。从活性污泥中分离得到的动胶杆菌对于多种有机毒物也有降解作用。

2.2 丛毛单胞菌属

丛毛单胞菌属和动胶杆菌属都属于活性污泥中最占优势的菌群，对于构成菌胶团也有重要的作用，除了可以吸附废水中的难降解有机物外，对于多种有机毒性分子也有降解作用，如丛毛单胞菌AN3菌株可降解苯胺，丛毛单胞菌CNB1菌株可降解对氯硝基苯等，因此，对于水的净化具有十分重要的意义，在污泥形成时应该着重培养。

2.3 放线菌

活性污泥处理厂的曝气池和二次澄清池中形成稳定泡沫和浮渣的报道很多。泡沫阻碍固体和液体分离，是活性污泥处理厂的一大问题。泡沫形成一般是由于含分枝菌酸的放线菌的生长和积聚造成的。泡沫和浮渣对于废水处理效果和环境都有一定的影响，因此在污泥的生成和废水处理过程中应该注意控制此类细菌的生长。

2.4 丝状菌

丝状菌是活性污泥的重要组成成分，是构成菌胶团不可缺少的一部分，按丝状菌相对的生长状况及数量多少菌胶团分为5个等级：A级：几乎没有丝状菌；B级：0～3根，属少量丝状菌；C级：3～6根，属中等数量的丝状菌；D级：6根以上，属大量丝状菌；E级：丝状菌过量生长，丝状菌延伸缠绕在一起或呈现网络状态。 当丝状菌达D级时，大量丝状菌从絮粒中伸展出来，形成“刺毛球”状的活性污泥骨架。这些伸向絮粒外部的无数“触手”阻碍了絮粒间的压缩，使污泥在二沉池大量流失。此时应立即检查各项运行条件，及时调整，因为从絮体中伸出的丝状菌具有较强的夺取食物和繁殖的能力，一旦继续增长，就会摆脱絮体的束缚致使絮体破碎，从而发展成为严重的丝状菌性污泥膨胀。

3 活性污泥中微生物菌群的主要研究进展

3.1 传统的活性污泥微生物菌群分析方法

传统的分离培养法是将定量样品接种于高浓度营养物的选择性培养基中，对生长的菌落计数，并通过观察各种微生物的生理生化特性及形态构造等进行种属分类鉴定。作为微生物研究的经典手段之一，分离培养方法在研究活性污泥菌群过程中起到十分重要的作用。

此法要求比较简单，很适合用来分离一些具有一定功能的微生物，还常用于一些科研工作者的初步研究。但是此法有很大的局限性：培养基对某些菌群的选择性；某些细菌和其它细菌之间有共生现象，不能单独生长（此类细菌占至今未能培养微生物的很大一部分）；很多细菌具有难以分辨的相似形态、生理生化特性。所以，此方法不能真实反映活性污泥菌群结构，尤其是对那些具有重要功能仍未能培养的菌群的检测。

由于传统纯培养技术在研究微生物多样性及其作用机理方面存在很大局限性，传统培养方法只能检测到很少部分细菌（占细菌总数的0.1%～1%），且培养分离周期长，工作量大，使得现有污水处理工艺中生物脱氮除磷与微生物之间的构效关系研究仍处于初级阶段。例如：生物标记物法中的脂肪酸图谱法虽然能够快捷有效地从环境样品中提取脂肪酸进行微生物菌群结构的分析，但也有一定的局限性：对微生物的分类水平较低，不能鉴定到种；对标记脂肪酸有强烈的依赖性；复杂的环境微生物样品中不同微生物种属之间脂肪酸组成的重叠和外来生物污染容易导致一定的偏差。醌类图谱分析术虽然是一种可靠的分析方法，然而也存在一定的局限性，它不能反映具体某个属或种的变化。

3.2 新发展的微生物菌群分析方法

近十余年来日益成熟的分子生物学分析方法给菌群结构的解析带来了新的希望。自20世纪80年代中期以来，包括呼吸链泛醌分析技术、核酸杂交分析技术、聚合酶链式反应分析技术、温度梯度胶凝胶电泳分析和16srRNA序列分析技术等在内的微生物分子生物学方法的研究和应用方面获得了飞速发展，极大程度地克服了环境样品研究中传统微生物分析方法固有的局限性，使废水生物处理系统的微生物生态研究及其在废水生物处理实践的应用拥有了十分先进的科学手段。这些新的分析方法，只需从混合的微生物样品提取总DNA，得到若干个基因组的混合物，然后通过分子标记技术分析混合物中不同基因组的多态型来反映样品的微生物种类组成。

3.2.1 16SrRNA—PCR技术

16SrDNA克隆文库技术可以通过直接从环境样品中提取微生物DNA或直接在原位对微生物进行研究，而不需对微生物进行分离培养，因而能够动态考察微生物种群结构，能够真实地反映微生物在处理系统内的真实存在情况。

高平平、赵立平等人在对含酚废水生物处理系统的研究中，针对4种不同类型的降酚菌设计专一性引物和探针，通过PCR扩增监测这些菌群在活性污泥中的动态变化及生态功能和地位，并将降酚菌的分类地位至少可以确定到属的水平。近年来也有人采用16srRNA—LPM方法分析活性污泥中主要微生物优势种类以及系统多样性的变化。它是采用基于长度多态性（Length Polymorphism）和GC含量的二维16srDNA分析方法，可以有效地分析环境中的细菌，特别是使用16srDNA中的变异区域I时，方法会更简便和有效。谢冰等人利用16srRNA—LPM方法分析了受重金属污染的活性污泥微生物生态系统中细菌的优势种类和多样性。

3.2.2 DGGE／TGGE技术

随着分子生物学的快速发展和聚合酶链式反应技术的日趋成熟，一些基于PCR技术的分子指纹技术，如：变性梯度凝胶电泳、末端限制性片段多态性和长度多态片段PCR，已开始应用于环境微生物种群结构和多样性分析。这些方法不受微生物实验室培养的限制，可以获取相对全面的种群信息。

变性梯度凝胶电泳（Denaturing Gradient Gel Electrophoresis, DGGE）和温度梯度凝胶电泳（Temperature Gradient Gel Eleectrophoresis TGGE）都是DNA指纹图谱技术。新近研究表明，DGGE对有多个不同碱基序列差异的DNA片段的分离有局限性，Sekiguchi等人认为，DGGE方法可能低估了环境微生物的种群多样性。所以必须把DGGE/TGGE和其它分子生物学方法相结合才能对环境样品中的微生物种群多样性进行更为准确的描述。

1993年Muyzer等首次将DGGE用于微生物生态学研究，分析了分子大小相同但序列不同的16srDNA片段，根据不同细菌其核糖体小亚基基因可变区碱基序列的不同，对其种群多样性、数量比例和系统等进行更为详尽的描述。DGGE和TGGE在微生物分子生态学方面的应用，不仅使得人们对复杂微生态系统的解析成为可能，也使得对微生物种群动态变化的研究成为可能，通常用指纹图谱中条带数目的多少来反映微生物种群的多样性，用条带的染色强度反映不同细菌种群的丰度。高平平、晁群芳等人用16srDNA—PCR／TGGE指纹图谱技术对一个焦化工业废水处理系统两个功能不同的曝气池活性污泥的细菌种群结构进行了动态分析，研究结果表明，两个曝气池中主要降解细菌类群是不同的。

3.2.3 微生物醌指纹法

除遗传基因外，近年来以特征化合物—微生物醌为标记的新的微生物群体组成解析方法，即醌指纹（Quinone Profile）法在环境微生物群体组成研究中有大量应用。该技术已经成为分析微生物种群的简单有效、灵敏度高、数据的信赖性高的方法，并成功地应用于生活污水和工业废水生物处理过程中微生物群体组成的确定。清华大学胡洪营等人利用醌指纹法对某一污水处理厂曝气池活性污泥微生物群体组成进行了研究，结果显示，在所研究的活性污泥中革兰氏阳性细菌含量高于革兰氏阴性。然而，醌指纹法也存在一定的局限性，它不能反映具体哪个属或哪个种的变化，因此如需对活性污泥中的微生物生态系统进行更详细的分析，还应结合其他方法进行深入研究。3.2.4 ERIC—PCR

ERIC（Enterobacterial Repetitive Intergenie Consensus，肠杆菌基因间的重复共有序列）是一个长度为126bp，以多拷贝形式存在于细菌基因组的非编码区的反向重复序列，该序列在细菌染色体上分布的多态性允许设计特异引物对其进行扩增而形成具有种、属、菌株特异性的指纹图谱，已经被广泛应用于纯培养细菌的鉴别、分类、基因组多态性和系统进化等方面的研究。ERIC—PCR与其他分子生物学技术相结合使用可以更加准确反映微生物群落结构，赵立平等人就是用微生物群落结构探针对不同培养基从活性污泥中回收优势菌的能力进行了评价。不同时期的活性污泥的总DNA的ERIC—PCR产物代表了样品中优势菌组成特征，这些扩增产物经标记后成为可以反映样品中优势菌组成的核酸探针，即所谓“微生物群落结构探针”。把不同培养基上分离到的所有细菌菌群混合，提取总DNA进行ERIC—PCR。用上述探针与回收菌的ERIC—PCR指纹图杂交，出现的杂交条带数目代表了活性污泥中的优势菌有多少被特定的培养基回收。

3.2.5 核酸探针分子杂交

核酸探针检测技术以核酸分子杂交技术为核心，利用探针分析DNA序列及片段长度的多态性，具有特异性强、灵敏度高等特点，所以在生物多样性及生态功能的研究中具有十分重要的应用价值。Rossello—Mora等人利用专一的寡核苷酸探针研究了Zo—ogloea ramigera在活性污泥形成中的作用，结果表明丝状菌的过度生长会导致污泥膨胀。

Kawaharasak等对从活性污泥中分离出的新的聚磷菌（如Microlunatus Phosphorous）进行了原位定量分析，通过比较探针标记的细胞数目和含聚磷酸盐的细胞数目后认为，在EBPR除磷工艺中Microlunatus Phosphorous占整个含聚磷酸盐的细胞总数的1/3。Hesselmann等和Crocetti等利用对β-Proteobacteria专一的探针，结合细胞内聚磷酸盐颗粒的特殊染色技术，鉴定了实验室规模的除磷反应器中占优势的微生物类群。

另外，专一性寡核苷酸探针在人们对硝化过程微生物的认识中也被广泛应用。不同的研究者利用不同的专一性探针对活性污泥、生物滤床等环境中的硝化细菌进行研究。

3.2.6 荧光原位杂交技术

近年来，针对传统的微生物分析方法存在的问题，废水处理领域的一些研究者开始尝试将荧光原位杂交技术（Fluorescent In Situ Hybridazation，FISH）用于引起污泥膨胀的丝状菌菌群、脱氮细菌菌群、除磷菌菌群、产甲烷菌菌群等的分析，并取得了初步的成功。谢冰、徐华等人采用FISH方法对活性污泥样品中的硝化细菌进行了检测，表明它对环境中的可用显微镜观察但不可培养的微生物的检测也是十分有效的。

FISH作为微生物数量和特性考察的手段，具有种属特异性，即只与目标细菌的16SrRNA或23SrRNA结合，通过结合的探针可以鉴定微生物的种类。与其他可以将微生物量化的方法（如定量聚合酶链式反应即PCR）相比，FISH技术可以同时考察微生物种群的结构和数量信息。研究表明，技术对特定微生物种群定性和定量时，获得结果快，可自动读取保存和回顾载物片信息，灵敏度高选择性好取样易且少，并能提供较多的物理参数。

FISH技术的优势在于可以了解微生物在污泥中的数量、形态及分布状态等，但其在应用过程中还存在着检测的假阳性、假阴性问题，诸如：微生物自身荧光的影响、探针缺乏特异性、穿透率不足、低rRNA含量和荧光褪色等。

4 展望

活性污泥法作为现在污水处理的主力已经越来越受到人们的重视。活性污泥中的微生物菌群随着现代研究方法的发展也逐渐被发现和认识，但是还没有被认识完全，有些重要的菌群还没有被发现。随着各种科学技术的发展，新的研究方法还将应用于污泥微生物菌群分析，如免疫培养技术和现代培养技术在国外已经取得了一定的成果，但是国内相关研究很少。在国内活性污泥菌群及其他环境微生物的研究中尚有很大的应用前景。随着新方法的建立，活性污泥的菌群结构会更好地为人所认识。对于将来更好地利用活性污泥，揭示废水处理系统中生物与环境之间的生态学关系以及为实现废水处理系统的优化运行具有深刻的理论研究意义与实际应用价值。

（略）