徐艳阳，陈佳丽，李科静，林雨婷，朱志红，吴海成

（吉林大学生物与农业工程学院，吉林长春130022）

玉米苞叶为禾本科玉米属一年生草本植物玉米（Zea mays L.）的外苞叶。资料记载玉米的根、叶、花柱、轴均可供药，有调中开胃、益肺宁心、利水通淋、抗氧化和解毒去疾之功效[1-2]。我国是玉米生产和种植大国，玉米产量居世界第二位[3]，种植面积约2 449.83 万hm2，每公顷玉米可采集苞叶600 kg，所以玉米苞叶资源十分丰富，易于收集。但是大量的玉米苞叶没有得到有效利用。黄酮类化合物在植物中分布最广，是天然产物化学领域中研究较成熟的一类物质，有预防心血管疾病、防癌抗癌、调节免疫、抗衰老、抗菌抗病毒、抗炎抗过敏、止血镇痛等功效[4-5]，被列为保健食品的一类功能因子。

目前关于玉米苞叶中黄酮类成分的提取和功能研究较少。国内学者王艳[6]对玉米苞叶中黄酮类化合物进行了提取和鉴定。孟雪[7]等用大孔树脂分离纯化了玉米苞叶总黄酮。鲁萍[7]等对玉米苞叶总黄酮的超声提取和体外抗氧化活性进行了研究。张沐新[8]等对玉米苞叶中新黄酮类化合物进行了分离和鉴定研究。甄艳军[9]等研究发现玉米苞叶水提物具有降低动脉硬化家兔血脂及防治动脉硬化的作用。微波辅助提取是近年来发展较快的一种天然产物提取技术，具有操作简便、易控制、快速和提取率高等优点，被广泛用于天然植物中黄酮类化合物、生物碱、皂苷类等有效成分的提取[10-15]。因此本文利用微波法对玉米苞叶中黄酮类化合物的提取工艺进行研究，为玉米苞叶的开发利用奠定基础。

1 材料和方法

1.1 材料

玉米苞叶采集于长春市农贸市场，清洗，烘干，粉碎过60 目筛，备用。

1.2 试剂

芦丁标准品（HPLC≥97 %）：天津市光复精细化工研究所；亚硝酸钠、硝酸铝、无水乙醇、氢氧化钠：北京化工厂生产；所用试剂均为分析纯。

1.3 主要仪器

FW177 型中草药粉碎机：天津市泰斯特仪器有限公司；AL104 型电子分析天平：梅特勒-托利多仪器有限公司；LD4-2A 型雷勃尔低速离心机：北京雷勃尔离心机有限公司；MM721AAU-PM 美的微波炉：佛山市顺德区美的微波电器制造有限公司；TU-1810 型紫外分光光度计：北京普析通用仪器有限责任公司。

1.4 试验方法

1.4.1 玉米苞叶中黄酮的提取工艺

玉米苞叶→清洗→烘干→粉碎→微波处理→离心→定容→测定

1.4.2 芦丁标准溶液的配制

精密称取20.00 mg 芦丁标准品置于10 mL 容量瓶中，用60%乙醇溶液定容至刻度，摇匀，得到2.00 mg/mL芦丁标准液[13]。再用移液管准确量取2.00 mg/mL 标准液1.00 mL 于10 mL 容量瓶中，用60%乙醇定容、摇匀，作为标准对照液。

1.4.3 芦丁标准曲线的制备

准确移取芦丁标准对照液0.00、0.50、1.00、1.50、2.00、2.50 mL，分别置于10 mL 容量瓶中，加入60%乙醇溶液至4.00 mL，5 %NaNO2溶液0.50 mL，10 %的Al（NO3）3溶液0.50 mL，摇匀后静置10 min，再加入4.00 mL 5%NaOH 溶液，用60%乙醇溶液定容至10 mL，摇匀后静置10 min，然后在510 nm 波长处测定吸光度值，以吸光度值为纵坐标（y）、芦丁标准对照液的质量浓度为横坐标（x）绘制标准曲线。

1.4.4 玉米苞叶中黄酮含量的计算

采用硝酸铝显色法[16]测定玉米苞叶中黄酮的含量，其计算公式如下：

式中：S 为玉米苞叶中黄酮含量，（mg/g）；C 为玉米苞叶提取液中黄酮的浓度，（mg/mL）；V 为玉米苞叶提取液的体积，mL；N 为稀释倍数；M 为玉米苞叶的质量，g。

1.5 单因素试验设计

1.5.1 微波时间对玉米苞叶中黄酮含量的影响

准确称取玉米苞叶样品1.00 g，用60%乙醇溶液按料液比1 ∶10 溶解，在功率为119 W 微波炉中提取2、3、4、5、6 min，然后离心，定容到10 mL，测量玉米苞叶中黄酮的含量。

1.5.2 乙醇浓度对玉米苞叶中黄酮含量的影响

准确称取玉米苞叶样品每份1.00 g，分别按料液比1 ∶10，加入浓度为60%、70%、80%、90%、100%乙醇溶液，在功率为119 W 微波炉中提取2 min，然后离心，定容，测量玉米苞叶中黄酮的含量。

1.5.3 料液比对玉米苞叶中黄酮含量的影响

准确称取玉米苞叶样品1.00 g，分别按料液比1 ∶10、1 ∶20、1 ∶30、1 ∶40、1 ∶50，加入60%乙醇溶液，在功率为119 W 微波炉中提取2 min，然后离心，定容，测量上玉米苞叶中黄酮的含量。

1.5.4 微波功率对玉米苞叶中黄酮含量的影响

准确称取玉米苞叶样品1.00 g，按料液比1 ∶10、加入60%乙醇溶液，分别在功率为119、252、385、539、700 W 微波炉中提取2 min，然后离心，定容，测量玉米苞叶中黄酮的含量。

1.6 玉米苞叶中黄酮提取条件的优化设计

在单因素试验的基础上，应用Box-Benhnken（BBD）试验设计进行优化研究，各因素的水平设置及编码见表1。

表1 试验因素水平编码表Table 1 Coded variables and levels of facters

1.5 数据处理与分析

采用Design-Expert 8.05 软件对试验数据进行方差分析，根据回归方程、响应曲面图及等高线图分析出各因素之间交互作用的显著性。

2 结果与分析

2.1 芦丁标准曲线的绘制

按1.4.3 在510 nm 波长处测定芦丁标准品的吸光度值，其结果见图1。

图1 芦丁标准曲线Fig.1 Standard curve of rutin

由图1 可知，芦丁标准品的线性回归方程为y=12.171x-0.001 3，R2=0.999 8，该方程的回归系数较高，说明芦丁的浓度与吸光度值具有良好的线性关系。

2.2 单因素试验

2.2.1 微波时间对玉米苞叶中黄酮含量的影响

按1.5.1 中的操作方法考查微波时间对玉米苞叶中黄酮含量的影响，其结果见图2。

图2 微波时间对玉米苞叶中黄酮含量的影响Fig.2 Effects of microwave time on flavonoids yield from corn bracts

由图2 可知，随着微波时间的延长，玉米苞叶中黄酮含量先升高后降低，当微波时间为3 min 时，玉米苞叶中黄酮含量最高。其原因可能为当微波时间大于3 min 时，提取液体积损失较多，同时有部分玉米苞叶中黄酮类物质被氧化，因此微波时间选择3 min 为宜。

2.2.2 乙醇浓度对玉米苞叶中黄酮含量的影响

按1.5.2 中的操作方法考查乙醇浓度对玉米苞叶中黄酮含量的影响，其结果见图3。

图3 乙醇浓度对玉米苞叶中黄酮含量的影响Fig.3 Effects of ethanol concentration on flavonoids yield from corn bracts

由图3 可知，随着乙醇浓度的增加，玉米苞叶中黄酮含量逐渐升高，当乙醇浓度达到80%时，黄酮含量最高，当乙醇浓度大于80%后，黄酮的含量降低，其原因可能为当乙醇浓度大于80%后，玉米苞叶中脂溶性物质溶出增多，干扰了黄酮类物质的提取和检测。但是由于脂溶性物质溶出增多给玉米苞叶中黄酮的纯化带来了较大的麻烦，从成本和黄酮含量的角度综合考虑，乙醇的浓度选择80%较佳。

2.2.3 料液比对玉米苞叶中黄酮含量的影响

按1.5.3 中的操作方法考查料液比对玉米苞叶中黄酮含量的影响，其结果见图4。

图4 料液比对玉米苞叶中黄酮含量的影响Fig.4 Effects of Solid-Liquid ratio on flavonoids yield from corn bracts

由图4 可知，当料液比为1 ∶20 时，玉米苞叶中黄酮含量最高，其原因可能为当料液比大于1 ∶20时，玉米苞叶中杂质溶出较多。从增加提取率和减少溶剂用量节约成本等方面综合考虑，料液比选择1 ∶20较合适。

2.2.4 微波功率对玉米苞叶中黄酮含量的影响

按1.5.4 中的操作方法考查微波功率对玉米苞叶中黄酮含量的影响，其结果见图5。

图5 微波功率对玉米苞叶中黄酮含量的影响Fig.5 Effects of microwave power on flavonoids yield from corn bracts

由图5 可知，随着微波功率的增大，玉米苞叶中黄酮含量呈下降趋势，其原因可能为当微波功率过大即超过539 W 后提取液容易产生爆沸，损失较大。因此微波功率选择252 W 为宜。

2.3 响应面试验优化及分析

2.3.1 模型的建立与显著性检验

以微波时间、乙醇浓度、料液比和微波功率为影响因素，应用BBD 响应面设计，优化玉米苞叶中黄酮的提取条件，方差分析结果见表2～表3。

由表2 可知，设立了5 个中心试验点即零点来估计试验误差。利用Design-Expert 8.0.5 软件建立响应面二次回归模型，以玉米苞叶中黄酮含量为响应值Y（%），经二次回归拟合后得到回归方程为：

该方程的回归系数为R2=0.902 1，因此可以用该回归方程来表示各因素值和响应值之间的函数关系。最佳理论预测条件为：微波时间4 min、乙醇浓度84.89%、料液比1 ∶10（g/mL）、微波功率355.73 W，在此条件下玉米苞叶中黄酮含量可达到0.613（mg/g）。

表2 响应面设计及结果Table 2 Results of Response surface design

表3 回归模型的方差分析Table 3 ANOVA of regression model

表3 中微波时间、乙醇浓度、料液比和微波功率的一次项均达到了显著水平（P＜0.05）；在二次项中，乙醇浓度和微波功率对试验结果的影响显著；在交互相中，微波时间和乙醇浓度的交互作用及微波时间和料液比的交互作用对玉米苞叶中黄酮含量有显著性影响，而其它因素的交互作用影响不显著。由表3 可看出，模型的显著水平为极显著，方程的失拟项不显著，说明该回归模型是可靠的，因此可以用该回归模型对试验结果进行分析和预测。

2.3.2 响应曲面图形分析

响应面图形是响应值对应于试验因素A、B、C 和D 所构成的三维空间曲面图及其在二维平面上的等高线图，响应面图形可以直观地反映各因素及他们之间的交互作用对响应值的影响[17-18]。对交互作用显著的响应面图形进行分析，结果见图6 和7。

由图6 可以看出，玉米苞叶中黄酮含量随微波时间的增大而升高；随乙醇浓度的增加先增大后减小。微波时间对玉米苞叶中黄酮含量的影响显著。与微波时间相比，乙醇浓度对黄酮含量的影响不太显著，且随其数值的增加或减少响应值的变化较小。由图7 看出，玉米苞叶中黄酮含量随微波时间的增大而升高；随料液比的增加而降低。微波时间对玉米苞叶中黄酮含量的影响显著。与微波时间相比料液比对黄酮含量的影响不太显著，且随料液比的增加或减少响应值的变化较小。

图6 微波时间和乙醇浓度交互作用对玉米苞叶中黄酮含量的影响Fig.6 Effects of microwave time and ethanol concentration interaction on flavonoids yield from corn bracts

图7 微波时间和料液比交互作用对玉米苞叶中黄酮含量的影响Fig.7 Effects of microwave time and Solid-Liquid rate interaction on flavonoids yield from corn bracts

2.3.4 最佳工艺条件的预测和验证

由二次回归方程得玉米苞叶中黄酮提取工艺的最佳理论预测条件为：微波时间4 min、乙醇浓度84.89%、料液比1 ∶10（g/mL）、微波功率355.73 W，在此条件下玉米苞叶中黄酮提取率为0.613 mg/g。为了检验预测结果与实际情况是否一致，考虑到实际情况，最佳工艺条件修正为：微波时间4 min、乙醇浓度85%、料液比1 ∶10（g/mL）、微波功率385 W，在此条件下进行五次验证试验，得到玉米苞叶中黄酮含量为（0.586±0.024）mg/g，与预测值基本相符，说明该二次回归方程与实践情况拟合较好。

3 结论

1）研究微波时间、乙醇浓度、料液比和微波功率对玉米苞叶中黄酮含量的影响，通过响应面优化设计得到影响玉米苞叶中黄酮含量的因素顺序为：微波功率＞微波时间＞料液比＞乙醇浓度，且对玉米苞叶中黄酮含量的影响均显著。

2）以玉米苞叶中黄酮含量为Y（%），经二次回归拟合得到的回归方程为：

Y（%）=0.52+0.03A+0.02B-0.02C+0.03D+0.03AB-0.02AC+0.01BC+0.01BD+0.01A2-0.04B2-0.02C2-0.02D2（R2=0.9021）

3）利用Design-Expert 8.0.5 软件建立响应面二次回归模型，得出微波提取玉米苞叶中黄酮的最佳工艺条件为：微波时间4 min、乙醇浓度85%、料液比1 ∶10（g/mL）、微波功率385 W，在此条件下玉米苞叶中黄酮含量为（0.586±0.024）mg/g，与理论预测值基本相符，可为玉米苞叶中黄酮类化合物的工业提取工艺研究提供参考。

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