梁华伦，江秀娟，陈地灵

（1.广东省中医院二沙分院药剂科，广州广东510515；2.广州市海珠区食品药品检验所，广东广州510250；3.广东省微生物研究所，广东广州510070）

棕榈[Trachycarpus fortunei（Hook.）H.Wendl.]是中国最普遍的土生土长的棕榈科植物，它原产中国中南部山地，是最耐寒的棕榈，在我国长江以南地区广泛栽培，现在世界上许多国家已有引种。棕榈既是观赏植物，又是经济植物；全身（根、茎、叶、花和种子）都有用，其中含有多种化学成分，有很高的利用价值。棕笋为棕树（Fortunes Windmill Plam）的花穗，花单性，肉质圆锥花序生于叶丛中，有明显的大形花苞，花淡黄色而细小，初出苞的花穗花小多数密集如鱼子，古称棕笋（又名木鱼）。花萼和花冠均三裂，雄蕊6 枚，子房三室，心皮基部合生，花期4～5月[1]。分布全国各地，资源丰富。《本草纲目》认为，其笋及子花，气味：苦、涩、平，无毒。主治涩肠，止泻痢肠风，崩中带下。常作为菜果食用，也可制糖[2]。其含有大量酚酸类、黄酮类化合物，还含有色素类、微量元素、挥发油等成分[3]，具有多种生物活性[4-7]。本实验就其酚酸类成分开展提取工艺筛选研究，以期为其资源的综合开发利用提供研究基础。

1 仪器和材料

1.1 仪器

紫外可见光分光光度计：美国Agilent8453E 型；德国Sartorius BP211D 电子分析天平（d=0.000 01 g）；XS 225A 型分析天平（d=0.000 1 g）。戴安Ultimate 3000型高效液相色谱仪（包括四元泵，自动进样器，柱温箱，DAD 检测器，Chromeleon 工作站）；AR224CN 电子天平（d=0.0001 g）：奥豪斯仪器（上海）公司；SK3300LH超声仪：托利多仪器上海有限公司；IKA RV10 HB10 basic 旋转蒸发仪：德国IKA；HHS-4S 水浴锅：上海宜昌仪器纱筛厂；Memmert model 100-800 烘箱：德国Memmert 公司。Acclaim C18（250 mm×4.6 mm，5 μm，Dionex），Syncronis aQ C18（250 mm×4. 6 mm，5 μm，Thermo）；TDL-2B 离心机（Anke 公司）；ELX808 多功能酶标仪：Bio-tek，美国；Agilent8453E 型紫外可见光分光光度计：Agilent 公司，美国。

1.2 材料

棕笋于2013年2月采集江西赣州赣县，经广州中医药大学中药学院林励研究员鉴定为棕榈科[Trachycarpus fortunei（Hook.）H.Wendl.]线棕的未开放花蕾。经70 ℃烘干，标本存于华南师范大学药物研究院植物标本室（编号：ZS20130221）。没食子酸（MUST-13040103）、原儿茶酸（MUST-12103006）、原儿茶醛（MUST-13021902）和咖啡酸（MUST-12042403）对照品均购自于成都曼斯特生物科技有限公司；1，1-二苯基-2-三硝基苯肼（1，1-Diphenyl-2- picrylhydrazyl radical 2，2-Diphenyl-1- （2，4，6-trinitro phenyl）hydrazyl，DPPH·），Sigma Aldrich Chemical Co.（USA），批号20110304；抗坏血酸，Sigma Aldrich Chemical Co.（USA），批号20100226；三氯乙酸（Trichloroacetic acid，TCA），天津市福晨化学试剂厂，批号20100201；硫代巴比妥酸（2-Thiobarbituric acid，TBA），aladdin chemistry co.Ltd，批号49837；液相用乙腈为色谱纯；实验用水为重蒸馏水；其余试剂均为分析纯。

2 方法与结果

2.1 样品溶液制备

2.1.1 对照品溶液制备

分别取干燥至恒重的没食子酸、原儿茶酸、原儿茶醛和咖啡酸对照品适量，精密称定，置25 mL 量瓶中，加20%甲醇溶液使溶解，并稀释至刻度，摇匀，即得含浓度分别为0.064、0.208、0.048、0.156 mg/mL 的没食子酸、原儿茶酸、原儿茶醛和咖啡酸混合对照品溶液。

2.1.2 供试品溶液制备

取棕笋粉末2 g，精密称定，加入20%乙醇25 mL，在80 ℃水浴中浸提30 min，提取2 次，滤过，少量20 %乙醇洗涤药渣，合并，定容到100 mL，即得供试品溶液。

2.2 总酚酸的测定

取没食子酸对照品适量，精密称定，于50 mL 容量瓶中，加20%甲醇溶解并稀释至刻度，配成0.61 mg/mL的标准液，分别吸取0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 mL 没食子酸标准液，稀释并定容至10 mL，配制成质量浓度系列浓度的标准溶液。精确吸取上述标准溶液0.4 mL 于10 mL离心管中，加入0.2 mol/L FC 试剂1 mL、15%Na2CO3溶液2 mL，蒸馏水定容至8 mL，25 ℃反应2 h。另精确吸取20%乙醇0.4 mL，同法操作作为空白对照。在765 nm波长处测量其吸光度。绘制吸光度与浓度的标准曲线，并拟合线性回归方程，A=1.425 8C+0.034 9，r=0.999。线性范围0.122 0 mg/mL～0.610 0 mg/mL。

2.3 4 种酚酸类成分的含量测定

色谱条件，Acclaim C18（250 mm×4.6 mm，5 μm，Dionex）色谱柱，流动相乙腈-0.4%磷酸水，梯度洗脱，柱温30 ℃；流速1.0 mL/min，检测波长275 nm。并参照文献[9]进行线性关系、精密度、稳定性、重复性和加样回收率等方法学考察试验。结果没食子酸、原儿茶酸、原儿茶醛和咖啡酸在棕笋中均能达到很好的分离，见图1，同时方法学考察试验结果显示均符合要求。

图1 棕笋对照品和样品HPLC 图谱Fig.1 Chromatograms of the four mixed reference standards and the sample of the buds of T.fortunei

2.4 单因素考察试验

2.4.1 料液比对棕笋酚酸类成分提取率的影响

取棕笋粉末2 g，精密称定，按料液比分别为10、20、30、50 倍（g/mL）加入50%乙醇，在80 ℃水浴中浸提30 min，提取2 次。滤过，少量50%乙醇洗涤药渣，合并，定容到200 mL，0.4 mL 于10 mL 离心管中，照“2.2”项下方法，在765 nm 波长处测量其吸光度，计算总酚酸类成分提取率；照“2.3”项下方法，测定4 种酚酸类成分含量，结果见图2。

图2 料液比对棕笋酚酸类成分提取率的影响Fig.2 Effects of ratio of liquid to solid on extraction of the buds of T.fortunei

实验结果，如图2 显示，不同料液比的棕笋酚酸类成分提取率无显著性差异（p＞0.05），从环保和节能角度出发，选择料液比10 倍量。

2.4.2 乙醇浓度对棕笋酚酸类成分提取率的影响

取棕笋粉末2 g，精密称定，按料液比10 倍，分别加入10 %、30 %、50 %、70 %、100 %乙醇（ν ∶ν），在80 ℃水浴中浸提30 min，提取2 次。滤过，少量相应浓度乙醇洗涤药渣，合并，定容到200 mL，照“2.2”项下方法，在765 nm 波长处测量其吸光度，计算总酚酸类成分提取率；照“2.3”项下方法，测定4 种酚酸类成分含量，结果见图3。

图3 乙醇浓度对棕笋酚酸类成分提取率的影响Fig.3 Effects of concentration of alcohol on extraction of the buds of T.fortunei

从图3 中可以看出，随乙醇浓度的升高，酚酸类成分提取率逐渐增大，当乙醇体积分数达到50%时，提取率达到最大，往后随着醇浓度的加大，酚酸类成分提取率变化不大。

2.4.3 提取时间对棕笋酚酸类成分提取率的影响

取棕笋粉末2 g，精密称定，按料液比10 倍加入50%乙醇，在80 ℃水浴中分别浸提15、30、45、60、75、90 min，提取2 次。滤过，少量50%乙醇洗涤药渣，合并，定容到200 mL，照“2.2”项下方法，在765 nm 波长处测量其吸光度，计算总酚酸类成分提取率；照“2.3”项下方法，测定4 种酚酸类成分含量结果见图4。

图4 提取时间对棕笋酚酸类成分提取率的影响Fig.4 Effects of extracting times on extraction of the buds of T.fortunei

提取时间考察试验结果表明，棕笋酚酸类成分提取率随提取时间的延长而增大，并在30 min 时提取率达到最大，继续延长时间，提取率基本保持不变。

2.4.4 提取温度对棕笋酚酸类成分提取率的影响

取棕笋粉末2 g，精密称定，按料液比10 倍加入50%乙醇，分别在30、50、70、90 ℃水浴中浸提30 min，提取2 次。滤过，少量50%乙醇洗涤药渣，合并，定容到200 mL，照“2.2”项下方法，在765 nm 波长处测量其吸光度，计算总酚酸类成分提取率；照“2.3”项下方法，测定4 种酚酸类成分含量，结果见图5。

图5 提取温度对棕笋酚酸类成分提取率的影响Fig.5 Effects of extracting temperature on extraction of the buds of T.fortunei

实验结果表明，棕笋酚酸类成分提取率随提取温度的升高而增大，并在50 ℃达到最大，随后提取率随温度升高基本不变。

2.5 正交试验

采用L9（34）正交表进行试验设计，结合单因素试验结果，进一步考察乙醇浓度（A）、提取时间（B）、提取温度（C）对棕笋酚酸类成分提取率的影响，以总酚酸提取率（T1）和4 种酚酸类成分总含量（T2）各占50%为考核指标，确定最佳提取工艺。因素与水平见表1。

表1 因素水平表Table 1 Factors and levels of orthogonal test

表2 正交试验结果与直观分析Table 2 Result of L9（34）orthogonal experiment and analysis

结果如表2 所示，方差分析结果见表3。

表3 L9（34）正交实验方差分析表Table 3 ANOVA analysis of L9（34）orthogonal experiment

由表2 可知，影响棕笋酚酸类成分提取的主次因素为B＞C＞A，即提取时间＞提取温度＞乙醇浓度。从表3 可知各因素对棕笋酚酸类成分提取率的影响均未达到显著水平，其最佳提取工艺条件应为A1B2C2，即乙醇浓度50%、温度50 ℃、每次提取30 min、提取2 次。

2.6 验证试验

按上述最佳提取工艺对棕笋酚酸类成分进行5次实验，结果5 次实验得到提取液中总酚酸类成分平均含量为50.79 mg/g，RSD%=1.26，4 种成分总量为6.35 mg/g，RSD%=1.25，说明最佳工艺条件稳定可靠，结果见表4。

表4 验证试验结果Table 4 The results of verifying test

2.7 抗氧化活性测定

2.7.1 DPPH 法测定抗氧化能力[8]

准确移取样品待测液2.0 mL，加入2 mL 0.2 mmol/L DPPH 溶液（取适量DPPH 固体溶解于80 %乙醇的50 mmol/L Tris-HCl 溶液中），混匀，放置一段时间，以无水乙醇调零，测定517 nm 波长处的吸光度，记为A样品。准确移取样品待测液2.0 mL 与无水乙醇2.0 mL，混匀，放置一段时间，在517 nm 处的吸光度，记为A对照。准确移取DPPH 溶液2.0 mL 与无水乙醇2.0 mL，混匀，在517 nm 波长处的吸光度，记为A空白，按下公式计算DPPH 清除率：

2.7.2 清除·OH 能力测定-脱氧核糖法[9]

取1.5 mL 反应液（0.1 mmol/L EDTA，0.1 mmol/L FeCl3，2.8 mmol/L 脱氧核糖），先后加入0.1 mL 抗坏血酸（1 mmol/L），0.35 mLH2O2（20 mmol/L），37 ℃水浴30 min。上述混合液加入1 mL 样本溶液再次37 ℃水浴30 min，随后依次加入0.3 mL TBA（0.2 mmol/L）和1 mL TCA（0.06 mmol/L）100 ℃水浴15 min，532 nm 处测定吸光值A1（以蒸馏水代替TBA 作为空白调零），同时用1 mL 蒸馏水代替样本溶液时的吸光度A0作为阴性对照。

2.7.3 Fe2+络合能力测定

取1 mL 不同质量浓度样品溶液（0～40 mg/mL）与3.7 mL 甲醇和2 mmol/L FeSO4·7H2O 0.1 mL 混合，反应30 s 后，加入5 mmol/L 亚铁嗪0.1 mL，混合均匀后室温下反应10 min，在波长562 nm 处测得样品吸光度。以样品本身溶剂为空白样本，每个样品平行3 次，取平均值。

式中：A0为空白样本吸光度；A样为样品吸光度。

本实验结果显示，见表5。

表5 棕笋中总酚酸类成分的抗氧化活性结果Table 5 The values of IC50 of extracts from the buds of T.fortunei（mean±SD，n=3）

棕笋总酚酸提取物清除DPPH 的IC50为0.69±0.02，清除DPPH 的IC50为0.56±0.01，络合Fe2+的IC50为0.84±0.03，约为维生素C 抗氧化能力的一半，由此可见，其抗氧化能力较强。

3 讨论

棕榈在我国长江以南地区广泛栽培，棕榈既是观赏植物，又是经济植物；全身（根、茎、叶、花和种子）都有用，其中含有多种化学成分，有很高的应用价值。棕苞一般从每年的11月份到次年的3月份可以采摘，剥去外层棕皮即可取得。棕苞味甘微苦，口感较好，具有降血压和清凉解暑的作用，含有多种氨基酸、淀粉、失水乳糖和蔗糖等，是山珍食谱中的佼佼者。但对于其的开发利用还不够。因此，本文通过正交试验，确定了棕笋中总酚酸的最佳提取工艺条件应为乙醇浓度50 %、温度50 ℃、每次提取30 min、提取2 次，其提取率可达50.79 mg/g。经验证实验证明，本提取工艺稳定可靠，可作为棕笋中酚酸类化合物的提取工艺。

近年来，氧化应激给动物细胞和组织带来的危害成为人们关注的热点，其机制是氧分子失去了外围电子形成的自由基会夺取其他细胞分子的外围电子，使自身保持稳定，造成一种连锁反应，使机体组织细胞分子受到损害。因此，研究天然抗氧化物，从根本上预防自由基氧化损伤迫在眉睫。植物多酚作为新型饲料添加剂成为国内外动物营养学界的一个研究热点。植物多酚是广泛存在于植物体内的天然产物，是植物的次生代谢产物，具有独特的生理活性和药用价值，多酚具有较强的清除自由基、抗氧化活性、抗衰老等生物活性功能。酚羟基极易被氧化成为醌类而提供氢，棕笋中具有的多酚类结构化合物中具有连或邻酚基，作为抗氧化剂其活性高于一般的非酚类或単酚基类抗氧化剂。本实验所检测到的没食子酸、原儿茶酸、原儿茶醛和咖啡酸均为多酚类化合物，因此，棕笋可作为抗氧化剂开发原料。随着棕榈研究的深入，相信棕榈综合利用和开发一定会有很好的广阔前景。

[1] 曹红星,吴翼.棕榈科植物现状及展望[J]. 江西农业学报, 2008(12):52-54

[2] 胡建湘.棕榈的利用—棕榈糖[J].科普旅游,2008(1):20

[3] 杨医亚.中医学[M].北京:人民卫生出版社,1999:30-41

[4] 王清,辛勤,李军,等.棕榈花蕾提取液对大鼠回肠平滑肌收缩活动的影响[J].济宁医学院学报,2005,28(4):5-6

[5] 刘善庭,王清,李健美,等.3 种棕榈花蕾提取液对大鼠离体子宫平滑肌作用的比较研究[J].中国中医药科技, 2003, 10(4):228-229

[6] 齐汝霞,王清,张鹏,等.棕榈花蕾水提液对兔离体肠平滑肌作用的影响[J].中国民族民间医药杂志,2006(79):115-116

[7] 卢汝梅,张宏建,李兵,等.棕榈花蕾提取物对小鼠离体子宫平滑肌收缩功能的影响[J].中国民族民间医药杂志,2009(11):56-57

[8] Cardador-Martinez,A, Loarca-Pina,G, Oomal,B D. Antioxidant activity in common beans(Phaseolus vulgaris L.)[J]. J Agri＆Food Chem,2002,50(24):6975-6980

[9] Nagai T, Myoda T, Nagashima T: Antioxidative activities of water extract and ethanol extract from field horsetail(tsukushi) Equisetum arvense L.[J].Food Chem,2005,91(3):389-394