齐薇薇 邵宗鸿 (天津医科大学总医院血液科，天津 300052)

调节性T 细胞(regulatory T cells，Treg)是具有免疫调节功能的T 细胞亚群，包含CD4+T 细胞、CD8+T 细胞、CD4-CD8-T 细胞及部分自然杀伤细胞等。Treg 不仅在自身免疫耐受的获得和维持及自身免疫防御中起着重要作用，而且在肿瘤、移植耐受甚至是病原体感染等免疫反应调节中也扮演重要角色。近年来Treg 与再生障碍性贫血(Aplastic anemia，AA)发病之间的关系也日益受到人们重视，特别是CD4+Treg 研究最多，本文就此方面研究进展做一综述。

1 CD4 +Treg 的产生和分类

Treg 概念在1970 年代由Gershon 等提出，近年来其作用日益受到研究者重视［1］。目前认为CD4+Treg 的产生有两种途径，即胸腺发育和外周诱导，由胸腺内自然发育而来的，称为天然调节性T 细胞(natutal Treg，nTreg)，为CD4+CD25+Treg;而诱导型Treg(induced Treg，iTreg)则由外周CD4+T 细胞经抗原或细胞因子刺激后表达CD25 而生成。

1.1 nTreg 1995 年，Sakaguchi 等［2］在对小鼠自身免疫性疾病(AID)进行研究时，首先发现了一个CD4+T 细胞亚群，该亚群细胞持续高表达CD25 分子，且还证明CD4+CD25+T 细胞能够通过下调对外来抗原或自身抗原的免疫应答水平，来维持自身免疫耐受，这一过程是非抗原特异性的;这些CD4+CD25+T 细胞无论在体内还是在体外动物实验中均显示其调节功能。在人体，功能和表型与小鼠类似的Treg细胞也得以发现。nTreg 在小鼠和健康人体中约占CD4+T 细胞的5%～10%，占人外周血单个核细胞1%～2%，主要分布在外周血和脾脏中。目前认为，大部分Treg 为CD4+CD25+T 细胞，其在维持自身免疫耐受中的关键作用也已公认，具体表现为抑制T 细胞增殖及细胞因子和自身抗体的产生，并调节树突状细胞(DC)及单核巨噬细胞功能［3］。

1.2 Tr1 调节性T 细胞 Tr1 是一类经克隆产生的iTreg，由已被异源活化的人或鼠CD4+T 细胞在白介素(IL)-10 作用下生成。Tr1 最早是从成功进行人类白细胞抗原(HLA)不相合骨髓移植的重症联合免疫缺陷患者体内分离出来的。随后，对初始CD4+T 细胞多次使用IL-10 进行刺激或应用不成熟DC 联合维生素D3 及地塞米松进行刺激，都可获得Tr1［4］。Tr1 的免疫抑制功能主要依赖于其所产生的具有免疫调节功能的细胞因子，Tr1 可产生高水平的IL-10 和转化生长因子(TGF)-β、中等量的IL-5、少量的IL-2 和γ 干扰素(IFN-γ)，不产生IL-4。目前大部分研究显示Tr1 以不依赖于叉头样转录因子P3(FOXP3)的方式表现其对效应T 细胞抑制功能。Passerini 等［5］从一名X 连锁、多内分泌腺病、肠病伴免疫失调综合征(IPEX)患者外周血中成功分离出Tr1 细胞克隆，同时发现将IPEX 患者初始CD4+T 细胞在体外进行培养可获得FOXP3 突变的Tr1，此Tr1 低表达FOXP3 而高表达颗粒酶B。但另有学者在寻常型天疱疮病例中发现两个Tr1 亚群，其中一群Tr1 表达FOXP3［6］。

1.3 Th3 调节性T 细胞 Th3 是另一类对黏膜免疫有重要意义的iTreg。研究显示口服髓鞘碱性蛋白(MBP)可诱导产TGF-β 的Th3 细胞生成，此Th3细胞对MBP 有特异性并且可抑制实验性自身免疫性脑脊髓膜炎［7］。Th3 可表达某些nTreg 分子如CD25、细胞毒T 淋巴细胞相关蛋白4(CTLA-4)，但是否表达FOXP3 现仍有争议［8］。Th3 细胞是一独立的T 细胞亚群，主要分泌TGF-β，对Th1 和Th2 细胞都具抑制作用。虽然Th3 经抗原特异性途径诱导产生，但却以非抗原特异性途径发挥其抑制作用，其抑制作用主要通过接触非依赖途径及通过分泌TGF-β 体现。TGF-β 可影响多种类型细胞的功能，故Th3 细胞可能在免疫调节及维持T 细胞稳态过程中扮演重要角色［9］。

2 CD4 +Treg 的标志分子及其作用机制

2.1 细胞毒T 淋巴细胞相关蛋白4(CTLA-4) nTreg 组成性表达CTLA-4，CTLA-4 是nTreg 发挥抑制抗原提呈细胞(APC)功能时所必需的，而CTLA-4表达缺失会导致系统性淋巴组织增殖及T 细胞介导的致命性AID［10］。初始T 细胞表面的CD28 与APC 表面的CD80/CD86 配体结合，是促使T 细胞增殖、分化的最重要的第二信号，而在T 细胞活化后，由于CTLA-4 对CD80/CD86 配体有更高的亲和力，两者结合形成负调节信号，同时也诱导APC 产生吲哚胺加双氧酶，导致色氨酸耗竭及毒性代谢产物形成而最终抑制T 细胞增殖。Verhagen 等［11］研究对MBP 多肽特异的T 细胞受体(TCR)转基因小鼠模型在CTLA-4 存在和缺失的情况下，CD4+CD8-胸腺细胞对自身抗原识别发生改变，从而减少Treg 细胞产生同时增加外周自身反应性T 细胞(Tconv)的识别范围;进一步研究发现，T 细胞识别范围改变是Treg 和Tconv 细胞通过其TCR Vα 和Jα 片段选择以及互补决定区3(CDR3)α 组合改变所实现;因此认为CTLA-4 通过调节胸腺中Tconv 早期发育，从而在中枢耐受中扮演重要角色。

2.2 叉头样转录因子P3(Forkhead box P3，FOXP3) FOXP3 基因位于人染色体Xp11.23～Xp13.3，属于叉头/翼状螺旋转录因子家族，含有11 个外显子，在人类中高度保守。FOXP3 对Treg 的生长及抑制功能均起关键作用，因此FOXP3 这一胞内标志物对Treg 的鉴别具有重要意义。在小鼠中，FOXP3 仅表达于Treg，在CD4+CD25-效应T 细胞的激活过程中则未见表达;而在人类，FOXP3 不仅表达于Treg，也可被诱导表达于CD4+CD25-效应T 细胞并使其具备抑制功能［12］。天然T 细胞的TCR 结合到自身抗原肽/主要组织相容性复合物(MHC)配体上，并通过细胞内下游信号通路激活特定转录因子结合到FOXP3 基因启动子或增强子区，从而调控FOXP3 基因转录。FOXP3 的增强子区域具有激活T 细胞核因子(NFAT)和信号转导蛋白SMAD3 的特异结合位点，使得NFAT 和SMAD3 作为调节nTreg 分化的重要转录因子，可以协同诱导FOXP3 基因表达［13］。另外，TCR 激活后诱导Treg 特异型CpG 岛的低甲基化，此低甲基化过程是FOXP3+T 细胞获得特异性Treg 基因表达、保持细胞稳定性及维持抑制活性所必需［14］。FOXP3 可能通过抑制转录过程中细胞因子及细胞表面抗原基因的表达而发挥作用，例如FOXP3 通过第二外显子编码区与转录因子RORγt相互作用，抑制RORγt 对IL-17A 启动子的激活作用，促进静息T 细胞向Treg 发育［15］。

2.3 白介素受体(CD127) CD127 表达于初始CD4+及CD8+T 细胞以及记忆CD4+及CD8+T 细胞表面，但其表达随T 细胞激活而逐渐降低。研究发现，Treg 中CD127 与FOXP3 表达呈负相关，因此结合CD4、CD25 高表达而CD127 低表达，可鉴定出具有高度抑制活性、高表达FOXP3 的Treg［16］。而Klein［17］测定系统性硬化症患者CD4+CD25+CD127(low/-)细胞中FOXP3 表达水平，结果显示(34.0%±15.1%)的CD127(low/-)细 胞 不 表 达FOXP3，同时有(30.3%±7.4%)的CD127+细胞表达FOXP3，研究表明CD127 低表达和FOXP3+不代表同一细胞群。

2.4 神经菌毛素1(Neuropilin 1，Nrp1) Nrp1 是血管内皮细胞生长因子受体，参与神经轴突导向、血管形成及T 细胞的激活，在CD4+CD25+Treg 表面组成性表达并且与其激活状态无关。初始CD4+CD25-T 细胞在其TCR 激活后Nrp1 表达下降，高表达Nrp1 的CD4+T 细胞亦高表达FOXP3 并且可抑制CD4+CD25-细胞，因此Nrp1 可作为Treg 特异性分子标记［18］。近期研究显示Nrp1 可作为区分nTreg 和iTreg 的表面标记，大部分nTreg 高表达Nrp1，而在黏膜中产生的iTreg 以及非炎症性iTreg 均低表达Nrp1;并且发现Nrp1 表达受TGF-β 调控［19］。

2.5 富含亮氨酸重复序列32(LRRC32) LRRC32又被称为糖蛋白A 主要重复(GARP)，广泛表达于除脑组织以外胎盘、肺、肾、心脏、肝、骨骼肌及胰腺等组织。LRRC32 mRNA 在激活Treg 高度表达，其产物为跨膜蛋白［20］。LRRC32 可介导FOXP3 表达并使Treg 具有抑制效应T 细胞(Teff)的功能;应用慢病毒或小干扰RNA(siRNA)抑制Treg 中LRRC32表达，导致Treg 对靶细胞抑制作用减弱。TGF-β 可以诱导LRRC32-CD25-细胞表达FOXP3，但不能上调LRRC32 表达，并且此类诱导的FOXP3+细胞不能抑制Teff。Chan 等［21］研究显示LRRC32 中一段17 个氨基酸的单肽切除对LRRC32 在nTreg 表面定位是必需的，并且LRRC32 可能影响某些T 细胞激活的标志分子表达水平;LRRC32+Treg 比LRRC32-Treg 具有更强的抑制功能，因此LRRC32 可作为筛选具有更强作用Treg 的标记分子。

2.6 转录因子Helios Helios 属于Ikaros 转录因子家族成员，主要表达于Treg。Getnet 等［22］研究发现CD4+CD25+Treg 中Helios 表达水平上调，通过染色质免疫共沉淀技术(ChIP)证实Helios 结合于FOXP3 的启动子;应用siRNA 敲除Helios 基因会下调FOXP3 表达水平，同时明显减弱nTreg 抑制功能。Thornton 等［23］研究显示在体外无论鼠或人TGF-β 诱导的iTreg 均不表达Helios，在体内抗原特异的iTreg 也不表达Helios，所以认为Helios 可能是nTreg 特异性分子标志。但近期一些研究显示Helios 可能不是区分nTreg 和iTreg 的适合标志:Akimova 等［24］认为鼠或人Treg、CD4+T 细胞及CD8+T 细胞在细胞激活和增殖过程中均有Helios 表达上调;而Zabransky［25］试验证实抗CD3/CD28 微珠可以刺激FOXP3+Helios+细胞产生，并且高表达Treg 活性分子标志，具有比传统Treg 更强的抑制作用。

3 AA 中CD4 +Treg 的异常及其在AA 发生发展中的作用

目前认为T 淋巴细胞异常活化、功能亢进是造成骨髓损伤、造血细胞凋亡及造血功能衰竭的主要原因。Treg 作为一类具有免疫调节作用的T 淋巴细胞亚群，在维持机体内环境稳定、肿瘤免疫监测、诱导免疫耐受及防止AID 的发生方面起着重要作用。目前研究表明，再障患者外周血亦存在Treg 数量和功能的异常。

Moon 等［26］研究了CD4+CD25highFOXP3+细胞在肿瘤性及自身免疫性血液系统疾病中的表达情况，结果显示恶性血液病无论是外周血还是骨髓，其中CD4+CD25high/CD4+细胞群及CD4+CD25highFOXP3+/CD4+细胞群均明显高于自身免疫性血液疾病;并且CD4+CD25highFOXP3+/CD4+细胞群在外周血中表达水平明显高于其在骨髓中表达。尹晓晓等［27］应用流式细胞术检测AA 患者治疗前后外周血CD4+CD25+CD127lowTreg 细胞并与正常对照比较，结果发现AA 初发组及未恢复组Treg/CD4+T细胞群分别较正常对照组及恢复组明显降低。王西阁等［28］检测AA 患儿Treg 得出一致结果，AA 患儿急性期外周血CD4+CD25+、CD4+CD25high、CD4+CD25+CD127low、CD4+CD25highCD127lowTreg 占CD4+T 细胞百分比均较恢复组及对照组显著降低;各组CD4+CD25highCD127lowTreg 表达率与外周血中血色素、白细胞和血小板数量均呈正相关。Slomou等［29］对获得性AA 研究中发现，病例组与健康对照组相比CD4+CD25+T 细胞、CD4+CD25+FOXP3+T细胞占CD4+T 细胞百分比及其绝对值均明显降低，经免疫抑制治疗(IST)3～6 个月后Treg 数量比治疗前有所提高。提示CD4+CD25+FOXP3+Treg 在绝大多数AA 患者中都是降低的，随着IST 有效，病情缓解，Treg 数量上升。另外Slomou 等［29］研究发现，CD4+CD25+细胞中FOXP3 基因和编码蛋白表达下降，NFAT1 不足甚至缺失。转录因子NFAT1 通过与FOXP3 启动子结合而诱导FOXP3 表达，另外FOXP3 需要与NFAT1 协同作用才能发挥对细胞因子表达的抑制作用及对CD25 的激活作用。转染NFAT1 至AA 患者CD4+CD25+FOXP3-细胞中，NFAT1 表达升高，FOXP3 表达也升高。相反，从Treg 敲除NFAT1，NFAT1 表达下降同时FOXP3 表达也下降。由此推测Treg 缺乏，自身反应性T 细胞增加机体免疫耐受被打破，启动自身免疫应答，免疫效应细胞增多，促进获得性AA 发生;给予IST，Treg数量能够恢复，同时伴随着疾病的好转。Kordasti等［30］研究AA 患者的CD4+T 细胞功能时发现，重型AA 患者Treg 数量明显少于正常对照及非重型AA 患者。AA 患者Treg 不能抑制来自正常对照的Teff。相反，AA 患者Teff 功能可以被正常人Treg 所抑制。Kordasti 认为抗原介导的Th1 细胞克隆性增殖，诱导Th1 型细胞因子的炎性环境是导致AA 患者Treg 数量减少，功能受损的主要原因。国内黄国清等［31］通过免疫磁珠法分离AA 初发组、AA 恢复组及正常对照组外周血中Treg，之后给予刺激培养，酶联免疫吸附试验检测Treg 分泌细胞因子的表达水平，结果显示初发AA 患者IL-10、IL-35、TGF-β 表达水平和正常对照组比较明显降低;而恢复组与正常组比较无明显差异。提示AA 患者Treg 分泌抑制性细胞因子能力降低，免疫治疗后AA 恢复期患者Treg 分泌细胞因子功能也有所恢复。Shi 等［32］研究显示，AA 患者外周血及骨髓中CD4+CD25+Treg 数量均减少，并且骨髓Treg 数量比外周血更少，而在正常对照组骨髓Treg 多于外周血Treg，提示AA 患者骨髓Treg/外周血Treg 比例倒置。通过实验证实AA 患者外周血Treg 低表达趋化因子受体(CXCR)4由此导致Treg 向骨髓迁移能力受损。将AA 患者的反应性T 细胞(Tresp)及细胞毒T 细胞(Tcyt)与自体Treg 共培养，Tresp 及Tcyt 仍表现出高增殖能力。为了证实AA 患者Treg 自身存在缺陷，研究者设计了交叉培养试验，AA 患者Treg 对正常Tresp 及Tcyt只有低水平抑制作用，而正常Treg 对其自体Tresp及Tcyt 具有较高程度的抑制作用;同样，对于AA 患者高反应性Tresp 及Tcyt，正常Treg 比AA 患者Treg表现出更强的抑制作用。结果提示AA 患者Treg 对Tresp 的免疫抑制功能受损，AA 患者Treg 自身存在功能紊乱。同时研究者通过体外培养试验证实AA患者Treg 抑制Teff 分泌IFN-γ 的能力明显减弱，因此加重Teff 对骨髓造血功能的损害。

4 CD4 +Treg 与AA 治疗

Treg 是一种低反应并具抑制作用的独特免疫调节细胞亚群，利用其强大的免疫抑制作用来抑制自身反应性T 细胞的活化，将是预防、诊断和治疗自身免疫性疾病的一条新途径。Chen 等［33］从小鼠脾脏及胸腺分离获得CD4+CD25+Treg，经尾静脉输入AA 小鼠体内，结果显示，输入同基因或异基因Treg 小鼠与未回输Treg 小鼠相比，回输Treg 小鼠CD8+T 细胞明显减少，骨髓细胞数量明显增多，外周血象明显改善。由于正常成人外周血CD4+CD25+Treg 占CD4+T 细胞比例较少，且增殖能力低，而应用于临床时所需要的细胞数远比这高得多，因此，研究Treg 的功能测定及分离培养、扩增，是目前AID 细胞靶向治疗的研究重点。Cao 等［34］研究证实，AID 患者外周血CD4+CD25+FOXP3+Treg 可以被提取、纯化、激活并扩增。经过3 个星期体外培养Treg 可以被扩增100～2 000 倍，同时扩增后Treg依然具有其功能表型，并且与从AID 患者新鲜提取的Treg 相比具有更强的对Teff 的抑制作用。成功分离并扩增自体Treg 也可能为AA 的免疫治疗提供理论基础及新的思路。

5 结语和展望

再障患者体内存在Treg 表达异常，进一步探讨再生障碍性贫血患者中Treg 表达和功能情况，将有望阐明再障患者机体的免疫调节机制;研究其在再障发病机制中的免疫调节作用，将为再障的免疫调控治疗策略提供有益的启示，使再障的免疫治疗手段取得新的突破。

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