马寅仲，杜冠华

（中国医学科学院·北京协和医学院药物研究所，药物靶点研究和新药筛选北京市重点实验室，北京 100050）

细胞分化伴随着不可逆的谱系定型（lineage commitment），这一现象主要受表观遗传机制的调节。Davis等［1］通过对转录因子MyoD的调控突破了表观遗传的控制，从而将成纤维细胞重编程并分化为肌细胞。随后Takahashi等［2］发现了只通过重编程4个转录因子（c-Myc、Oct3/4、Sox2、Klf4）便可以将人成纤维细胞重编程为诱导多能干细胞（induced pluripotent stem cells，iPSCs）。此项技术的发明为体外建立人类疾病细胞模型的研究开启了一扇新的大门。

最初的体细胞重编程技术使用逆转录病毒或慢病毒对转录因子进行转导［3］，但是由于c-Myc具有致癌性，且使用逆转录病毒本身也容易导致肿瘤的发生，这使得体细胞到iPSCs的重编程效率低下［4］。为了避免重编程过程中的基因修饰并提升获取细胞的效率，人们采用避免整合外源基因到宿主基因的策略来优化重编程技术。Stadtfeld等［5］在2008年首次使用腺病毒对大鼠肝细胞的Oct4、Sox2、c-Myc、Klf4四个转录因子重编程得到iPSCs，因为相对效率依旧不高，该方法并未得到广泛的应用。首个使用非整合型载体获得iPSCs的方法是通过对大鼠成纤维细胞进行反复的质粒转染实现的［6］，然而此方法操作繁琐，且效率仍旧较低，因此仍未获得广泛使用。Yu等［7］在2009年报道了使用非整合游离型载体-仙台病毒的重编程方法同样得到了iPSCs，该方法所得iPSCs的核型与原体细胞的核型一致，且同样具有分化为多种体细胞系的潜能。目前已有使用该种方法成功将人肾小管上皮细胞重编程并分化为βⅢtubulin（TUJ-1）阳性神经元或GFAP阳性星形胶质细胞的报道［8］。同样类似的方法还有使用PiggyBac转座子，在大鼠与人的成纤维细胞上均可以在不使用载体整合的情况下得到iPSCs［9］。随后人们在非整合基因的前提下，发现了一系列提高重编程效率的方法以进一步提升细胞获得效率，包括在重编程过程中加入小分子化合物以及与转录因子一并转入miRNA簇等方法［10-11］。

使用具有基因缺陷类疾病的患者体细胞重编程得到iPSCs后，再通过诱导分化成为具有一定病理表型的特定细胞谱系，这种构建体外疾病模型的方法被形容为“培养皿中的疾病”［12］。目前已有一系列应用帕金森病（Parkinson’s disease，PD）、阿尔采末病（Alzheimer’s disease，AD）以及亨廷顿病（Huntington’s disease，HD）的患者体细胞在体外构建具有病理特征神经元的报道。本文分别从家族型与散发型两个方面概括目前具有代表性的神经退行性疾病的体外疾病模型的建立，并分析了其在新药筛选中的应用潜力。

1 以iPSCs构建神经退行性疾病细胞模型

神经退行性疾病在病理上普遍以慢性进行性神经元结构与功能缺失为主要特征。至今人们已经从多种神经退行性疾病患者体细胞通过重编程得到iPSCs，主要包括PD、AD、HD以及肌萎缩侧索硬化（amyotrophic lateralsclerosis，ALS）等。

1.1 基于iPSCs的PD细胞病理模型构建 PD是一种常见的神经退行性疾病之一。其主要病理特征为脑内黑质多巴胺能神经元的进行性退化与神经细胞内富含α-synuclein的包涵体（Lewy bodies）［13］。近年来对这些复杂病理表征从基因层面进行的解释逐渐深入，目前已知的与PD发病直接相关的基因主要有 PARK2、SNCA、PARKIN、PINK1、DJ-1、UCHL1、LRRK2、PARK7、GBA、SNCAIP以及 ATP13A2［14-15］。在一项研究中，从具有3次 α-synuclein基因重复拷贝（SNCA）的PD患者体表获取成纤维细胞，对其中部分细胞重编程为iPSCs，并诱导分化为中脑多巴胺能神经元进行体外培养。结果发现患者的成纤维细胞并未表达α-synuclein蛋白，而来自iPSCs诱导产生的多巴胺能神经元表达的α-synuclein蛋白量比该患者健康直系亲属iPSCs衍生出的多巴胺能神经元所产生的蛋白量多出1倍以上［16］。其他一些研究也得出类似的结果，如取自PARKIN基因突变的PD患者体细胞重编程得到iPSCs后，诱导产生的中脑多巴胺能神经元由于单胺氧化酶A和B的表达高于正常细胞而使其对多巴胺的再摄取增加，进而表现为明显的氧化应激状态［17］。有趣的是，这种作用可以被腺病毒所转入的PARKIN基因反转。在另一项研究中，人们发现不论是家族型还是散发型PD，来源于二者的iPSCs分化所得多巴胺能神经元均表现出了LRRK2转录活性的低下。从形态学角度观察，与正常神经元相比，所得神经元的突起断裂现象更多，突起分支减少，自噬现象也更为明显［18］。

处于疾病晚期的神经元亚型通常对基因背景十分敏感，因此应用iPSCs在对此类模型的建立中存在一个明显的限制因素，即该技术无法在确定的基因背景条件下开展实验，从而无法通过基因修复验证病理表型的变化。为了解决这个问题，Soldner等［19］通过将锌指核酶（zinc finger nuclease，ZFN）介导的基因编辑技术与iPSCs技术相结合，得到与疾病同源的基因组，并控制修正所得iPSCs系的两个α-synuclein点突变易感基因，结果显示，分化所得多巴胺能神经元样细胞的病理特征与未经修正的细胞相比，其病理表征明显的减轻。这种基因修复的方法也标志着基因治疗研究的重大进展。

1.2 运用iPSCs构建AD体外细胞病理模型 AD是与年龄相关的最为常见的一种痴呆类型。由于人们对AD本身的发病机制缺乏了解，使得利用iPSCs建立AD模型与其他常见疾病相比更为复杂。AD以进行性神经元缺失结合Aβ淀粉样蛋白，神经纤维缠结（tau蛋白过度磷酸化）为主要的病理表征。尽管β淀粉样蛋白前体蛋白（amyloidβprecursor protein，APP）由β分泌酶与γ分泌酶的酶解异常被认为在AD发病中扮演一定角色，但AD的认知功能障碍与蛋白沉积、多种异常折叠Aβ、tau蛋白过度磷酸化之间的关系仍不甚明了。

早老素（presenilin，PS）基因为常染色体显性遗传，其被认为是早发型AD的诱因之一。在一项研究中，Israel等［20］选择PS1与重复APP基因突变的家族型AD患者，以及两种不同的散发型患者体细胞进行重编程，得到相应的iPSCs后诱导分化为皮层胆碱能神经元。结果发现两种来自家族型及一种散发型患者的细胞均表现出Aβ1-40与Aβ1-42的明显升高，且这种现象可被β分泌酶抑制剂，而不是γ分泌酶抑制剂特异性的阻断。值得一提的是，所有的细胞均表现出正常胆碱能神经元的电生理特性。Shi等［21］从唐氏综合症（down syndrome）患者体细胞重编程产生iPSCs，其3倍复制的21染色体中含有一段额外的APP基因拷贝。而且该iPSCs分化所得神经元也表征出了Aβ以及tau蛋白过度磷酸化等AD早期病理特征。综合分析，这些结果提示内源性APP蛋白水解通路以及与其有关基因突变对tau蛋白过度磷酸化与aGSK3β水平升高具有直接的作用，从而成为AD发病的病理机制之一。最近一项研究中，Koch等［22］展示了来自PS1（L166P）突变的AD患者的iPSCs诱导产生的胆碱能神经元中γ分泌酶功能的部分缺失，这种现象进而导致了Aβ40产量的降低，以及Aβ42/40比例的升高。非类固醇类抗炎药物（nonsteroidalanti-inflammatorydrugs，NSAIDs）对这些神经元样细胞的γ分泌酶的调节作用也十分微弱。该患者iPSCs的研究提示针对AD药物筛选的一个新靶点，以及在体外研究AD病理与人脑胆碱能系统的一个新的思路。

1.3 运用iPSCs构建HD细胞病理模型 HD是一种常染色体显性神经退行性疾病。它是由一个变异型亨廷顿基因（huntington gene），即一段过度扩张的CAG三核苷酸串联重复序列所编码的亨廷丁蛋白（huntingtin，htt）而引发的疾病［23］。该蛋白N端有1个拉长伸展的谷氨酰胺序列，该序列使htt蛋白的构象发生改变从而在特定神经元胞核附近聚集而产生毒性。

在过去很长一段时间内，人们采用了多种不同的技术建立HD疾病模型，如采用人源的非神经细胞（成纤维细胞或淋巴母细胞），来自大鼠、小鼠或永生化的人源胚胎干细胞（embryonic stem cell，ESCs））以及原代神经元，这些模型可以再现HD的部分病理表征［24］。近年，来自转基因HD猴子、大鼠和人类HD患者的iPSCs开始出现，使用该细胞系衍生的纹状体神经元与神经前体细胞，具有与HD患者相同的CAG扩张序列，并且对生长因子缺乏表现出更强的凋亡活性［25］。来自HD猴子的iPSCs衍生的纹状体神经元可以在体外培养中观察到其胞内聚集的htt蛋白，随着细胞的分化，还可见核包涵体的形成［26］。而使用R6/2转基因HD大鼠成纤维细胞重编程得到的iPSCs中，CAG重复序列对细胞增殖活力，脑源神经营养因子（brain-derived neurotrophi factor levels，BDNF）水平或神经发生潜能均没有明显影响。除此之外，这些iPSCs在增殖与分化过程中也并未表现出凋亡活性的增加。另外，由于观察到该HD大鼠体细胞中的一个溶酶体基因的转录出现上调，学者们发现该iPSCs的溶酶体数量也出现了明显的升高［27］。一项最近的研究进一步证实了来自HD患者的iPSCs能够在体外产生正常功能与亚型的神经元，且在移植入成年大鼠脑内之后仍具有分化神经元的能力。但是，在该iPSCs所分化得到的星形胶质细胞中观察到胞内大量空泡的产生，该现象也在患者体内的淋巴母细胞中被观察到［28］。以上结果提示，来自HD动物与患者的iPSCs能够在体外重现至少部分HD疾病的病理特征。对于该疾病的新靶点，可能存在于胆固醇代谢和星形胶质细胞分化有关通路之中，这对现有药物的筛选具有新的指导意义。

1.4 构建ALS细胞病理模型 ALS以肌萎缩和无力，伴随快速进行性的大脑与脊髓运动神经元退行性病变为主要病理特征［29］。绝大多数病例为散发型（sALS），大约10%为遗传型（fALS）。目前发现的有超过10个基因被认为与ALS发病有关，包括超氧化物歧化酶1（SOD1、ALS1）、交换应答DNA结合蛋白-43（TDP-43、ALS10）、融合肉瘤（FUS、ALS6）、靶面结合蛋白 B/C（VAPB、ALS8）、EPHA4受体等［30］。基于ALS动物模型在实验中的表现令人失望，建立新型ALS模型具有重要意义。

目前，已有4个研究小组成功的从3种不同家族型及1例散发型ALS患者体细胞获取iPSCs。Dimos等［31］从SOD1突变的患者体细胞得到iPSCs，并确认该细胞系具有ESCs的一些特性，并能够分化为运动神经元。但是，与ALS相关的病理表现却并未出现。Mitne-Neto等［32］通过与未患病直系亲属（空白对照组）相比，VAPB突变患者的iPSCs分化得到的运动神经元中VAPB蛋白水平明显减少，提示VAPB可能与ALS8的发病机制相关。该研究组进一步发现伴随向神经元的分化过程，空白对照组的VAPB呈逐渐增加，而ALS8突变组则未观察到此现象，提示ALS8的突变可能是造成VAPB蛋白水平无法升高的原因之一。而空白对照与ALS8突变组的VAPBmRNA水平并未观察到明显差异，说明这种细胞对VAPB的调节作用似乎发生在转录后阶段。

带有TDP-43突变的iPSCs能够分化为运动神经元，且所得的突变神经元表现出ALS的病理特征，如TDP-43蛋白的可溶性增加、细胞存活能力降低、对磷酸肌醇-3激酶（phosphoinositide-3-kinase，PI3K）通路抑制剂的敏感性明显提升等等。Kassa等［33］使用散发型ALS患者获得的 iPSCs分别诱导为上位与下位运动神经元，也同样观察到了类似的病理特征。他们选择TDP-43作为靶点，使用该ALS模型进行高内涵筛选，发现了包括地高辛在内的一系列FDA批准上市的小分子调节剂，具有降低该蛋白水平的作用。因此，研究患者iPSCs分化所得此类细胞的表型有助于发现ALS发病的新机制及新的药物作用靶点。

2 iPSCs与HCS

HTS是一种广泛用于早期药物发现的筛选技术。目前随着硬件与软件技术的不断进步，HTS已经可以结合具有亚细胞水平分辨率的显微镜，进行细胞图片分析与筛选技术，即HCS。与传统的HTS技术相比，同样的筛选速度，HCS能够得到更多数据，如细胞形态学变化、膜完整性、靶点外效应、细胞毒性评价等等。

使用iPSCs进行药物筛选的成功案例是振奋人心的，其对于特定类型患者进行小至中等数量的化合物药效与毒性的评估是十分宝贵的。如何使iPSC技术在药物研发与新药发现的过程中发挥更重要的作用，关键在于能否更为系统全面地评价在化合物刺激后的分化细胞的病理表型变化。iPSCs不仅能够携带特定突变，并具有确定的基因背景，与肿瘤细胞系相比其更能够保留体细胞的关键特性与相对正常的胞内信号网络，且保持低分化状态的iPSCs还具备良好增殖活力，从而能够不断地提供筛选用细胞。

传统HTS一次检测仅能得到培养皿内所有细胞某一靶点的信号之和，也就忽略了个体细胞反映的异质性与靶点外的信息。这种方法虽然具有针对性，但却因缺少形态学与靶点外的效应而造成假阴性结果的激增。HCS能够提供被观察目标在时间、空间与光谱范围内的变化。HCS是将HTS的多种测量指标汇总输出，得到化合物对细胞产生的较全面生物学效应的观察［34］。从以上特点综合分析，iPSCs更适合与HCS技术相结合，为每次筛选提供更多的化合物活性信息，大大减少了假阳性与假阴性的情况发生［35］。

3 使用iPSCs建立神经退行性疾病模型中亟待解决的问题

尽管使用iPSCs建立神经退行性疾病模型具有很好的发展前景，但在其应用过程中仍有一些亟待解决的问题。在对许多神经系统疾病使用iPSCs进行体外模拟时，我们仍旧无法观察到典型的病理表型。从分子层面分析，与疾病相关蛋白与全基因的表达可以通过iPSCs在体外反映出来，但对于神经退行性疾病晚期的病理表征，如PD患者多巴胺能神经元胞内的包涵体，使用患者体细胞所衍生出来的神经元就无法表现。

另一个方面，鉴于这些细胞系的表型多样性与患者的基因异质性，对于来自单一患者衍生的iPSCs而言，实验的重现性与数据的验证显得尤为重要。因此可通过尝试对所得iPSCs的基因缺陷进行修复的方法，作为验证这些疾病模型可靠性的手段。

4 前景与展望

人源iPSCs技术用于疾病模型的建立发展迅速。最近的研究成果允许科学家们在体外研究疾病病理表型，了解疾病状态下细胞的微环境以及进行新药发现与药物功能的测试。尽管重编程技术仍不够成熟，但目前不断破冰式的发展，已经帮助学者们克服了许多曾经无法解决的难题。iPSC技术为当前的药物发现提供了革命性的方法，它桥接了基因生物学、细胞生物学与生理学［36］。

首例人源iPSCs细胞系的建立至今不过5年时间，因此更多的研究成果是十分值得我们期待的。iPSCs在发现新活性化合物与探索发病机制方面的优势仍需大量的工作来验证。目前人们对使用人源iPSCs在体外建立慢性与感染性疾病的热情不断升温，相信在不久的将来，此项技术能为新药筛选与疾病机制探索提供实质性的帮助。

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