曹 清 朱清仙

(九江市第三人民医院，江西 九江 332000)

乙型肝炎病毒(HBV)是最常见的双链DNA病毒，其中HBV复制中间体为共价闭合环状DNA(ccc DNA)，为mRNA和前基因组RNA合成提供模板，是HBV复制的重要标志之一〔1〕。HBV感染导致的慢性乙型肝炎(CHB)诊断及疗效判断常用指标包括HBV荧光定量PCR、血清免疫标志物及肝功能等。目前基础研究证实，抑制或清除HBV ccc DNA是治疗CHB重要方法之一〔2〕。本研究旨在分析CHB患者丙氨酸氨基转移酶(ALT)、HBV DNA、ccc DNA及肝组织免疫组化的相关性。

1 资料与方法

1.1一般资料 随机选取2011年1月至2013年1月于我院治疗的CHB患者60例，根据有无接受正规抗病毒治疗分为未治疗组(n=42)和治疗组(n=28)。入选标准〔3〕：排除其他类型病毒性肝炎(甲、丙、丁、戊)重叠感染，排除酒精性肝病、脂肪肝、自身免疫性肝病和药物性肝炎等其他肝病。排除标准：肝癌、黄疸较深、明显腹水、明显出血倾向、多脏器功能衰竭及其他不适合肝穿活检者。所有患者签署知情同意书。未治疗组男26例，女22例，年龄21～53〔平均(33.3±5.5)〕岁，HBeAg阴性11例，阳性31例；治疗组男12例，女16例，年龄24～56〔平均(35.1±7.2)〕岁，HBcAg阴性7例，阳性21例。治疗组经聚乙二醇化干扰素α-2a抗病毒治疗48 w。自未治疗组中选取28例患者为对照组，男13例，女15例，年龄24～51〔平均(35.9±8.2)岁〕，HBeAg阴性6例，阳性22例，对照组和治疗组一般资料差异无统计学意义(P>0.05)。各组分别进行血清和肝组织ccc DNA检测及肝组织免疫组化检测。

1.2方法

1.2.1病毒学检测 血清HBV DNA检测采用荧光定量PCR技术，试剂盒由广州中山达安基因有限公司提供，阴性参考值为<1×103拷贝/ml。

1.2.2HBV标志物检测 血清HBsAg、抗HBs、HBeAg、抗HBe和抗HBc采用酶联免疫吸附法检测，试剂盒由上海科华生物工程股份有限公司提供。

1.2.3肝功能检测 血清天冬氨酸氨基转移酶(AST)、ALT、总胆红素(TBiL)、白蛋白(ALB)用全自动生化分析仪OLYMPUS AU 400检测，试剂由北京九强生物技术有限公司提供。

1.2.4肝脏活体组织穿刺病理检查〔4〕在彩超引导下进行肝穿刺活检，组织长度约1.0～1.5 cm，后用10%甲醛固定、脱水、石蜡包埋，切片(厚度4 μm)。采用苏木素-伊红(HE)常规染色，冰冻切片胶原纤维(MASSON)三色染色及网状纤维染色，采用CMIAS系列多功能真彩色病理图像分析系列读片。同时进行Knodell HAI和纤维化评分。对肝组织进行免疫组化标记，试剂盒购自北京中杉生物技术有限公司。

1.2.5肝组织cccDNA实时荧光定量PCR的特异性检测 使用眼科剪将离心管中的肝组织剪碎，并加入10倍体积的抽提缓冲液并振摇使其完全分散于溶液中。将裂解细胞的悬液置于50℃水浴中3 h。等体积经0.5 mol/L Tris.cl(pH 8.0)平衡的酚加入溶液中并缓慢地来回颠倒离心管10 min。形成乳浊液后于室温以5 000 r/min离心15 min，使两相分开。用大口径移液管(出口径为0.3 cm)将黏稠的水相移至一洁净的离心管中，用酚重复抽提2次。酚抽提取第三次将全部水相移至另一离心管中，于室温加0.2体积的10 mmol/L乙酸铵和2倍体积的乙醇，充分混合，即形成DNA。测定DNA样品在260 nm和280 nm处的光吸收。将DNA贮存于4℃冰箱。荧光检测仪自动读取并记录CT值，计算出拷贝数。

2 结 果

2.1未治疗组患者血清学资料 未治疗组中HBeAg阳性与阴性患者之间ALT水平〔(149.43±56.38)vs(135.45±67.47)U/L〕差异无统计学意义(P>0.05)。HBeAg阳性患者血清HBV DNA水平〔(6.84±1.24)log10IU/ml〕和肝细胞HBV ccc DNA水平〔(5.71±1.22)log10IU/ml〕均较HBeAg阴性患者〔(5.12±1.27)、(4.37±1.14)log10IU/ml〕显著升高(P<0.05)。

2.2未治疗组实验室指标与肝纤维化分期的相关性分析 未治疗组患者肝细胞中HBV DNA(r=-0.215，P=0.034)和ccc DNA水平均与肝组织纤维化程度呈负相关，其中ccc DNA呈强相关性(r=-0.523，P=0.004)，与ALT水平则无相关性(r=0.024，P=0.796)。肝细胞HBV DNA和ccc DNA之间未显示相关性(r=0.064，P=0.642)。与ALT水平则无相关性(r=0.037，P=0.784)。

2.3肝细胞内HBV ccc DNA与血清HBV DNA水平的相关性分析 对所有80例患者进行分析，结果提示肝细胞内HBV ccc DNA水平〔(5.7 ± 1.5)log10IU/ml〕与血清HBV DNA〔(6.1 ± 1.3)log10IU/ml〕无相关性(r=0.079，P=0.525)。

2.4抗病毒治疗患者体内HBV标志物的表达水平 治疗48 w后肝细胞HBV DNA、 ccc DNA〔(2.85±1.12)、(3.17±1.12)log10IU/ml〕较对照组〔(5.45±1.43)、(5.86±1.53)log10IU/ml〕显著下降(P<0.05)。

3 讨 论

HBV感染是全球性公共卫生问题之一，全球约20亿人曾感染过HBV，慢性HBV感染者约有3.5亿人成为，我国慢性无症状HBV携带者约1.2亿〔5〕。新发的或时间相对较短的CHB患者检测HBeAg阳性，被称为HBeAg阳性的CHB。但随着感染时间的延长，部分患者出现了HBeAg阴转或血清学转换，从而导致了HBeAg阳性的CHB患者比率逐渐下降，而HBeAg阴性的CHB患者比率逐渐升高〔6〕。在HBeAg阴性期，HBeAg检测阴性、ALT持久正常(PNAL)、血清HBV DNA水平很低或不可测、肝活检显示肝脏炎性坏死程度极微或无炎性坏死和肝纤维化程度极轻微到轻微，绝大多数患者处于非活动性、病毒低复制状态(非活动性HBV携带状态)，但部分HBeAg阴性患者会发展为免疫激活状态(即HBeAg阴性CHB)，主要表现为ALT升高及高血清HBV DNA水平〔7〕。肝细胞核内有稳定的ccc DNA存在，是慢性感染的基础之一，核苷类抗病毒药不能清除ccc DNA以致停药后复发。因此只有彻底清除细胞内ccc DNA才能根治HBV感染。诊断肝脏纤维化的金标准是肝组织的病理切片检查，但操作存在风险性，因此高特异性及敏感性的血清学指标是肝纤维化诊断学研究的热点方向。有报道称，CHB患者血清内检测到高含量HBV ccc DNA，动物实验发现与肝组织损伤严重程度(肝脏病理评分的高低)有关〔8〕。肝细胞内以及血清HBV ccc DNA与肝脏组织纤维化程度之间的关系，可通过更大样本量试验进一步证实。

本研究显示血清中ccc DNA水平与ALT值密切相关，从而说明患者血清中ccc DNA水平是肝脏损害的标志，可作为反映肝功能的又一临床参数。另外，肝组织纤维程度与肝细胞HBV ccc DNA呈负相关，HBV DNA水平与肝内病毒复制情况不存在相关性。

4 参考文献

1应若素，杨 湛，陈燕宇，等.丙氨酸氨基转移酶水平正常与轻度升高慢性HBV感染者的肝脏病理学特征比较〔J〕.中华肝脏病杂志，2012；20(8)：585-8.

2饶 敏，陆 伟，张占卿，等.慢性乙型肝炎患者肝组织HBV ccc DNA、总HBV DNA与血清HBV DNA的相关性及其与临床的关系〔J〕.肝脏，2012；17(6)：381-4.

3张 琳，吴 峰，石理兰，等.HBV携带者血清病毒标志物和HBV DNA与肝组织中HBV ccc DNA相关性的研究〔J〕.中华实验和临床病毒学杂志，2011;25(2)：112-3.

4中华医学会肝病学分会，中华医学会感染病学分会.慢性乙型肝炎防治指南2010年版更新版〔J〕.中华实验和临床感染病杂志：电子版，2011;5(1)：79-100.

5李韦杰，李伯安，赵景民，等.54例慢性乙型肝炎患者肝组织乙型肝炎病毒共价闭合环状DNA与血清HBsAg定量检测结果分析〔J〕.中华肝脏病杂志，2011;19(11)：815-7.

6李华东，江建宁，陆 晖，等.慢性乙型肝炎患者肝细胞HBV cccDNA、tDNA及HBV表面标志物的相关性研究〔J〕.中华实验和临床感染病杂志：电子版，2012;6(4)：300-3.

7陶 晨，叶 伟.乙型肝炎病毒感染患者血清ccc DNA检测及其临床应用〔J〕.肝脏，2012;17(2)：132-3.

8赵克开，王 青，缪晓辉，等.鸭肝损伤模型血清中鸭乙肝病毒ccc DNA的动态检测〔J〕.中华医学杂志，2010;90(35)：2509-13.