张峰 史增祥②

肿瘤的发生与发展是一个极其复杂的过程，涉及到多种因素、基因及环节，在肿瘤细胞多因素、多阶段的发生、发展过程中，抑癌基因能够充分发挥抑制作用。目前认为，肿瘤的发生由调节细胞增殖、凋亡、基因稳定性、血管生成、浸润或转移的基因异常所启动[1]。而抑癌基因可以抑制肿瘤的发生、发展，所以了解对细胞恶变起抑制作用的基因，将会为肿瘤发病机制的研究、早期诊断等提供线索。近年来，对肿瘤抑制基因的研究取得了较快的发展。Rap1GAP家族基因作为一种与肿瘤抑制相关的基因，近年来逐渐被人们所认识。Rap1GAP蛋白及其家族成员通常被认为是肿瘤抑制因子，分别参与不同的肿瘤抑制过程。一些研究发现Rap1GAP家族成员的失活与肿瘤有密切关系[2-5]。近年来，作为抑癌基因下调的重要机制，Rap1GAP启动子甲基化越来越受到重视，其研究取得了一些进展，本文就Rap1GAP及其启动子甲基化与肿瘤的关系的研究进展作一综述。

1 Rap1GAP生物学特性

Rap1（Ras proximate 1）是小分子G蛋白Ras家族的一员，1989年首先由Kitayama等[6]发现，Rap1在细胞粘附、分化、生长等功能的调节方面起着十分重要的作用[7-8]。人类多种恶性肿瘤可见到Ras基因的突变，作为Ras家族中的一员，Rap1与其他小分子G蛋白一样，Rap1有2种构象：无活性的GDP结合形式和有活性的GTP结合形式两种构象。Rap1活性的失调与恶性肿瘤的发生发展有关[9-10]。

Rap1GAP是Rap1的GTP酶激活蛋白，它可以特异性的增强内源性GTPase活性使Rap1结合的GTP水解成GDP，从而使Rap1失活[11]。由于Rap1GAP能特异性抑制Rap1的活性，通常被认为是肿瘤抑制因子，参与抑制肿瘤的过程。

1.1 Rap1GTP及其家族成员 具有Rap1GTP酶催化活性的蛋白分为两类，一类是Rap1GAP及剪接体Rap1GAp2，另一类主要包括SPA-l、E6TP1（E6-targeted protein 1）以及tuberin等[12]。

Rap1GAP主要表达在胚胎组织及某些肿瘤细胞系如肾母细胞瘤（Wilms’kidney tumor）SK-NEP-1和黑色素瘤SK-MEL-3等，已有资料显示Rap1GAP1的表达在黑色素瘤、甲状腺乳头状癌，、结肠癌、胰腺癌等多种人类肿瘤中均显著下降[3，5，13-17]。而Rap1GAp2则表达于血小板中[12]。研究发现，Rap1GAP2可降低活化形式的Rap1，从而抑制ERK/MAPK信号通路，起到抑制肿瘤的作用[12]。在体外伤口愈合试验中，通过过表达Rap1GAP2使Rap1失活后明显抑制了人脐静脉内皮细胞的定向运动[18]。显示其对血管新生有抑制作用，而血管新生是肿瘤新生、转移的基础，提示Rap1GAP2可能对肿瘤转移有抑制作用。

Rap1GTP的家族成员SPA-1、SPRA、E6TP1（E6-targeted protein 1）以及tuberin等亦起着抑制肿瘤形成的作用。例如：作为一种重要的Rap1GTP酶激活蛋白，SPA-l基因缺失在体内原始细胞白血病的生成中起重要作用[19]。E6tp1（E6-targeted protein 1）羧基末端的40个氨基酸残基在感染人乳头瘤病毒的细胞中与HPV16（human papilloma virus typel6）E6相结合，出现泛素化、蛋白酶降解，使Rap1持续活化，从而激活Rap1通路，促进肿瘤形成，揭示了HPV16形成肿瘤的分子机制[20]。其降解有可能与子宫颈癌等HPV感染相关肿瘤有关。Tuberin是由肿瘤抑制基因TSC2（tuberous sclerosis type 2）编码的含有1784个氨基酸的蛋白质产物，Tuberin对细胞生长呈负调控，有抑制细胞增殖和细胞周期的作用[21-23]。

1.2 Rap1GAP的结构 Rap1GAP定位于基因组lp36.1-35区域，该区域编码一个由663个氨基酸构成的蛋白质[24]。在细胞内，Rap1 GAP分子一般以二聚体形式存在，Rap1GAP分子主要由二聚化结构域和催化结构域两个结构域组成，每个结构域都有一个由α螺旋围绕的β折叠建构的特殊结构，C-末端的长α螺旋反向折叠至氨基末端的二聚化结构域并与之相结合[22]。

Rap1GAP结构域除了N端起始部位有一个19个氨基酸的小Go Loco的结构域（主要在细胞分裂过程中起作用）和在分子中段存在GAP活性结构域外，无其他明显结构域。Rap1GAP蛋白核心区的340个氨基酸位于75-415氨基酸，此部分核心区主要发挥水解GTPase的活性，且在其家族中是高度保守的，与其他小G蛋白的GAP区没有同源性[25-26]。其中，Rap1GAP的N端的第100位和173位氨基酸是导致Rap1GAP二聚化的关键位点，但在这两个结构域中，二聚化结构域对Rap1GAP的活性无影响[27-28]。第194和第285位的赖氨酸突变可明显降低其GAP活性[26]。Rap1GAP第290位的天冬酰胺突变为丙氨酸会导致其对Rap1活性的抑制能力几近丧失[27]。另外，Rap1GAP的第525位的丝氨酸具有稳定Rap1GAP的作用。当C-末端的氨基酸被切除后Rap1GAP可迅速被降解，说明Rap1GAP C-末端含有维持蛋白质稳定性的结构，能够防止Rap1GAP的降解[29]。

1.3 Rap1gap在细胞及组织中的分布 Rap1GAP是主要存在于组织细胞的细胞浆或细胞膜中，通过一定的循环机制在胞浆和胞膜之间进行动态分布[29-30]。Rap1GAP能与异三聚体G蛋白的Gai、Gaz和Gcto相互作用[30]。Rap1GAP与Gaz、Rap1相互作用结合成复合物结合并协调Gaz与Rap1之间的作用。另外，异三聚体G 蛋白活化可以明显减低胞膜区域中Rap1的活性，当Rap1GAP从细胞核周围区转移到胞膜区域时，其活性有升高的趋势，从而明显抑制Rap1的信号通路[31]。同时Rap1GAP2（Rap1GAP的一种亚型）能与Gi的Ct亚基特异结合，使Rap1GAP2能从胞质转移到胞膜区域，降低Rap1的活化，从而抑制ERK/MAPK信号通路，抑制肿瘤的生成[12]。前述Rap1GAP的二聚体形式不影响其在细胞内的定位[32]。

Rap1GAP主要在胎儿组织和肾母细胞瘤（Wilms’kidney tumor）SK-NEP-1、黑色素瘤SK-MEL-3等肿瘤细胞系中表达[13]。Rap1GAP的组织分布与其家族成员SPA-1存在相互交替的关系；在淋巴组织中主要是SPA-1的表达，而Rap1GAP几乎不表达[33]；相反在脑、胰腺、肾及神经等组织中的表达以Rap1GAP为主，组织中存在大量Rap1GAP的mRNA但SPA-1的mRNA极少。在人早幼粒细胞HL-60中表达SPA-1为主，而仅少量表达Rap1GAP，当早幼粒细胞分化为巨噬细胞时，上述情况出现逆转，细胞内主要表达Rap1GAP而仅有少量SPA-1表达[34]。正常骨髓细胞中，SPA-1和Rap1GAP均有表达，不过造血祖细胞只分泌SPA-1，当其开始分化时，Rap1GAP将会逐渐取代SPA-1，在成熟骨髓细胞中的表达以Rap1GAP为主，SPA-1呈低水平[35]。

2 Rap1GAP启动子甲基化与肿瘤的关系

2.1 Rap1GAP在肿瘤中的表达 许多研究证明，Rap1GAP在肿瘤中表达减低。如在乳腺癌、结直肠癌、甲状腺癌、口咽部鳞状细胞癌、肾癌、胰腺癌、黑色素瘤、宫颈癌、卵巢癌等多种恶性肿瘤中，Rap1GAP的表达均有明显下调，这种表现也正体现了其肿瘤抑制基因的功能，Rap1GAP表达减低导致其抑癌基因的功能减弱，从而促进了肿瘤的发生与发展[3，5，15，24，36-41]。例如，Zhang 等应用逆转录，实时荧光定量PCR的方法，检测正常组织及甲状腺癌组织中Rap1GAP的mRNA水平，发现在甲状腺癌组织中，Rap1GAP mRNA水平明显减低；采用免疫组化法检测Rap1GAP蛋白，结果显示与正常组织相比，甲状腺癌组织中Rap1GAP蛋白的阳性率明显降低[37]。并且，有实验表明随甲状腺癌的逐渐进展，Rap1GAP表达水平的降低愈发显著[3]。在子宫颈癌中，RapGAP mRNA和蛋白表达同样明显减低，并且与人乳头瘤病毒（HPV）的感染相关联[40]。在口咽部鳞状细胞癌，胰腺癌，肾癌，黑色素瘤等肿瘤中，Rap1GAP的表达均有明显的下调，而且随着肿瘤逐步进展，下调愈加明显[15，37-39]。说明Rap1GAP与肿瘤的形成及进展密切相关。

2.2 Rap1gap启动子甲基化对肿瘤的影响 作为真核生物遗传与遗传外修饰的重要的调控方式之一，DNA甲基化主要发生在CPG序列中的胞嘧啶5’-C位上，其对基因表达及调控作用重要。在近几年，甲基化在肿瘤中所起的作用逐渐受到重视.研究表明DNA甲基化不只是一种恶性转化的结果，很有可能在肿瘤发生、发展的全过程都扮演着重要角色[42]。

基因启动子是转录调节的重要区域，目前认为，在基因组的部分区域内，CpG序列密度较高，形成富含胞嘧啶C和鸟嘌呤G的区域，称为CpG岛。基因的启动子区通常是CpG岛定位的区域。当发生癌变时，原本处于非甲基化状态的抑癌基因启动子区CpG岛发生了甲基化，进而阻碍了基因启动子与转录因子二者之间的结合，使得基因转录被抑制，这也是抑癌基因在肿瘤发生时表达下调的重要机制之一[43]。

近年内，对Rap1GAP下调机制的研究取得了一些进展，目前认为对于抑癌基因减低机制的研究为肿瘤的靶向治疗提供了方向[44]。多数研究认为，启动子区甲基化是Rap1GAP重要的下调机制之一，在一些肿瘤的发生和生长过程，由于Rap1GAP的启动子高甲基化状态，而造成Rap1GAP表达下降，而使得有活性的Rap1GTP持续存在，MEK-ERK通路和Akt通路被异常激活，细胞生长失去抑制[45]；同时高Rap1GTP水平可能导致整合素β1的异常活化，导致细胞侵袭性增强，凋亡减少，并与肿瘤产生耐药性相关[46-50]。对于Rap1GAP的研究表明，在甲状腺癌中，其启动子区有3个CpG岛：CpG74A、CpG74B及CpG24出现甲基化的几率较大，实验中针对3个CpG岛分别设计甲基化及非甲基化引物，利用甲基化特异性PCR法（MS-PCR、MSP）检测Rap1GAP启动子的甲基化情况，结果显示，Rap1GAP的启动子存在明显的高甲基化，表明Rap1GAP表达减低与其启动子的甲基化有相关性[36，46]。CpG岛的甲基化可以阻碍基因启动子与转录因子的结合进而使转录受到抑制，导致Rap1GAP表达减低。在中国人群中的研究亦证明了此观点[47]。与之相同，启动子的甲基化机制在黑色素瘤中亦发挥重要的作用，有研究显示，利用MSP法检测到黑色素瘤中的Rap1GAP有4个甲基化位点（14583，11771，15138，14150）[48-49]；并且，使用DNA甲基化抑制剂 5-Aza-2’-deoxycytidine（5-Aza-CdR）处理黑色素瘤细胞后，Rap1GAP的表达水平上调，证明在黑色素瘤中Rap1GAP的下调与其启动子的甲基化有关[51]。EZH2（Enhancer of Zeste Homolog 2）是一种组蛋白甲基转移酶，通过使组蛋白3第27位赖氨酸残基发生甲基化及启动子甲基化后抑制转录的进行，进而导致基因沉默[50，52-54]。在侵袭性鳞状细胞癌中，EZH2通过促进组蛋白及基因启动子区域的甲基化抑制Rap1GAP的表达[53]。在肾癌中，Rap1GAP的下调也与启动子的甲基化有关，恢复Rap1GAP表达可能成为潜在的治疗肾癌转移的方法[38]。

综上所述，Rap1GAP作为肿瘤抑制基因，其启动子甲基化在肿瘤的发生、发展中发挥极其重要的作用，并且得到了国际、国内诸多专家学者的关注[54-57]。对于Rap1GAP启动子甲基化的研究虽取得了一定的进展，但是肿瘤的发生发展是一个复杂的多阶段、多步骤的进程，启动子甲基化是否是其他肿瘤Rap1GAP下调的机制，尚需进一步研究。对于Rap1GAP启动子甲基化的深入研究将为肿瘤的早期诊断，靶向治疗，抗多药耐药性等方面提供理论依据及研究方向。

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