朱梦玉 邵春益 傅瑶

角膜内皮细胞再生研究新进展

朱梦玉 邵春益 傅瑶

人角膜内皮细胞的主要功能是维持角膜透明性，角膜内皮单层发育成熟形成细胞接触后，内皮细胞会停止分裂增殖，但并没有退出细胞周期。角膜内皮细胞的增殖有多种因素的参与和影响，接触抑制和G1期抑制使细胞增殖暂时停止；细胞因子TGF-β2抑制人角膜内皮细胞进入细胞周期S期，而EGF、FGF、NGF则能够促进细胞的增殖；ROCK抑制剂Y-27632能够促进角膜内皮细胞的粘连，有助于内皮细胞的损伤修复。体外培养角膜内皮前体细胞、诱导多潜能干细胞向角膜内皮细胞分化，为今后治疗角膜内皮失代偿提供了新方向。

角膜；内皮细胞；细胞周期；细胞增殖；干细胞

角膜的解剖结构分为5层，由外向内依次为：上皮细胞层、前弹力层、基质层、后弹力层、内皮层[1]。角膜内皮层由单层角膜内皮细胞组成，通过屏障功能和离子泵功能维持角膜的透明性[2-3]。其中，人角膜内皮细胞（human corneal endothelial cells,HCECs）的形态完整和功能健全至关重要，同时内皮细胞密度必须保持在临界值400 ～ 500个/mm2以上才能维持角膜的通透性[4]。由于体内角膜内皮细胞增殖受限，角膜内皮层损伤修复的主要方式为内皮细胞体积增大和周边的细胞迁移，因此HCECs损耗过多会导致细胞密度降低或泵功能下降[5]，角膜内皮层的功能受损则会引起角膜水肿、透明性下降进而影响视功能，例如临床上常见的大泡性角膜病变，Fuch’s角膜变性等等。尽管穿透性角膜移植术和角膜内皮移植术能够重新恢复角膜透明性，但对供体角膜内皮质量和细胞数量要求较高，同时也存在术后免疫排斥、内皮失功、继发青光眼等问题[6]。由于供体角膜尤其是适合内皮移植的角膜严重缺乏，寻找新的方法来治疗角膜内皮失代偿成为目前研究的焦点。因为HCECs大多数处于细胞周期G1期，分裂增殖会暂时停止，所以HCECs难以用标准的细胞培养方式实现增殖[7]。因此，通过信号通路或细胞因子等影响因素调控内皮细胞克服G1期抑制是目前角膜内皮增殖相关研究的热点。本文将对HCECs增殖能力和再生的研究进展进行综述。

一、角膜内皮细胞的增殖能力

角膜内皮细胞的增殖能力在不同物种之间存在差异。鼠、兔和牛的角膜内皮细胞具有较强的增殖能力，在体外培养时能够快速地进行增殖分化。而猫、猴和人的角膜内皮细胞增殖能力较弱，在体外培养中增殖分化也相对较难[8]。

1.体内角膜内皮细胞的增殖能力：HCECs来源于胚胎期神经嵴细胞，角膜内皮层从出生后开始发育，HCECs会在角膜内皮单层发育成熟后停止增殖，且内皮细胞在正常条件下将终生保持无复制状态。所以，婴幼儿和成人体内HCECs分裂增殖速率远不能满足死亡或受损细胞的替换，导致HCECs密度随着年龄增长和损伤而降低。据统计，人体中HCECs的数量平均每年减少0.3﹪～ 0.6﹪[9]。但是，尽管成人体内的HCECs在细胞周期G1期受到抑制停止增殖，但没有退出细胞周期，仍具有分裂增殖的能力[8]。

2.体外角膜内皮细胞的增殖能力：从供体角膜分离得到的HCECs能够在体外培养成活，且能进行有限次数的传代[7]。Gerde等[10]使用Ki67染色离体角膜损伤模型的HCECs，研究结果显示在损伤部位的HCECs Ki67染色阳性，而损伤外周没有Ki67染色，由此推断当细胞接触抑制解除时，存在有丝分裂原的HCECs能够进入和完成细胞周期。

体外培养实验证实HCECs的活力受角膜供体年龄和角膜不同部位影响。年轻供体与老龄供体的HCECs相比，年轻供体的内皮细胞生长速度更快而且可传代次数更多[11-12]；中央和周边部HCECs的相对增殖能力也不相同，与周边部HCECs相比，中央和中央旁的内皮细胞具有较高的密度、较高的细胞表面变异系数，且六边形细胞所占百分比较低。另外，虽然各部位的HCECs密度均会随年龄的增长而降低，但周边部细胞密度的降低率最低，提示周边部的内皮细胞有祖细胞或干细胞样特性，可能周边部是角膜内皮再生的部位，可以向中央区提供内皮细胞[13]。

二、与角膜内皮细胞增殖相关的因素

1.接触抑制现象：角膜内皮层来源于胚胎期的神经嵴间充质细胞，随着眼部的发育，细胞由角膜的周边部向中央增殖和迁移从而形成单层角膜内皮，内皮细胞在细胞连接形成后因接触抑制停止增殖。Joyce等[14]使用初生大鼠的角膜内皮细胞研究细胞接触抑制，结果显示角膜内皮细胞增殖分化停止和成熟的细胞间连接形成的时间有相关性，且p27Kip1蛋白的表达量也会相应增加。由此推测，细胞周期依赖性蛋白激酶抑制因子（CDK inhibitors，CKIs）参与调节角膜内皮细胞接触抑制，其中CKIs家族主要成员Cip/Kip和INK诱导细胞停留于G1期[13]。Joyce等[15]、Yoshida等[16]对比p27Kip1蛋白水平在大鼠与人的角膜内皮细胞融合与亚融合培养接触抑制中的差异，研究发现p27Kip1蛋白水平在融合培养中的含量是亚融合培养的20倍，当融合培养使用EDTA解除细胞间连接后，p27Kip1蛋白的含量大大地减少。以上结果表明，p27Kip1蛋白在细胞接触抑制中起着重要作用。

2.G1期抑制：为了研究HCECs是否能被诱导分化从而克服G1期抑制，Joyce等[17]通过体外siRNA诱导使细胞p21Cip1蛋白和p16INK4a蛋白水平降低，研究发现进入细胞周期的HCECs数量增加，但p27Kip1蛋白水平降低只对年轻供体的HCECs产生作用。此研究证实了通过减少CKIs可以使HCECs克服G1期抑制，从而可以促进细胞增殖分裂。还有研究表明核转录因子E2F2的主要作用是激活细胞进入S期[18]，McAlister等[19]使用腺病毒载体将E2F2转入体外HCECs中，结果显示E2F2异位表达能够诱导HCECs进入S期，且HCECs密度显著增加，由此证实异位表达E2F2对HCECs的增殖分裂有促进作用。

3.生长因子：转化生长因子-β2（transforming growth factor-β2,TGF-β2)是稳定的多功能多肽生长因子，内源性TGF-β2在正常人房水中被激活且高浓度表达，对修复HCECs有重要作用[20]。研究表明TGF-β2的某些特定成分只在胚胎期的HCECs中存在，成人期不表达[21]。外源性和内源性TGF-β2均能抑制HCECs进入细胞周期S期。TGF-β2对内皮细胞的增殖抑制作用有显著的浓度和时间依赖性，可能与先后诱导p27Kip1蛋白和p21Cip1蛋白表达量的增加将内皮细胞拘留在G1/G0期有关[8]。TGF-β2以剂量依赖的方式抑制HCECs的增殖，而TGF-β I型受体激酶抑制剂可以阻断此作用。在HCECs的迁移过程中，暴露于TGF-β2的HCECs会增加细胞移行，且加入成纤维细胞生长因子2( fi broblast growth factor 2,FGF-2)后有协同作用。另外，由有丝分裂原激活的蛋白激酶（MAPK）信号通路参与HCECs的迁移，TGF-β2和FGF-2都能诱导p38磷酸化且共同作用时会产生协同效应[22]。

细胞信号转导也与HCECs的增殖有关。HCECs表达了一系列正性生长因子的受体，如表皮生长因子（epidermal growth factor,EGF）、FGF、神经生长因子（nerve growth factor,NSF）等，这些细胞因子对内皮细胞增殖有促进作用[13]。其中，EGF与受体结合后发生磷酸化作用能够发起信号级联反应使HCECs进入细胞周期，从而刺激内皮细胞的增殖[23-24]。特异性抑制蛋白酪氨酸磷酸酶（PTP1B）的活性，能够维持EGF诱导的EGF受体酪氨酸自体磷酸化作用，同时也能增加进入细胞周期的HCECs的数量。因此，抑制正性生长因子信号的下调可能增加增殖的HCECs数量[25]。

4.Rho/ROCK通路：Rho蛋白及其下游的Rho相关卷曲螺旋形成蛋白激酶（rho associated coiledcoil forming protein kinase,ROCK）是培养成纤维细胞和上皮细胞点状紧密连接的基本要素，Rho/ROCK通路对调节细胞连接和细胞运动性有重要作用[26]。Pipparelli等[27]研究指出ROCK抑制剂Y-27632作用于体外HCECs能够促进细胞连接和抑制凋亡、增加增殖的细胞数量和促进体外或动物模型中角膜内皮的损伤修复。Y-27632没有毒性作用，对细胞的活力也没有影响。Y-27632对诱导HCECs的增殖没有直接作用，但能够显著地增强内皮细胞的细胞连接、修复损伤和改变体内外细胞的形态，其中Y-27632对HCECs的细胞连接的影响有时间和剂量依赖性[28]。

三、体外角膜内皮细胞的增殖培养

1.角膜内皮细胞培养方法：使用组织工程或角膜内皮细胞替换疗法，将体外培养的HCECs直接注射入体内，这种方式有助于缓解供体角膜的缺乏[29-30]。从供体角膜分离的HCECs可以在体外培养，内皮细胞能在细胞接触抑制解除后进入和完成细胞周期，且能够有限次数地传代。Li等[7]发现了一种有效的体外分离、培养和扩增HCECs的方法，使用胶原酶A从供体角膜消化分离得到HCECs，置于无血清高钙培养液中，在经过短暂的胰蛋白酶/EDTA处理后，HCECs能够在添加激素的上皮细胞培养液（SHEM）中增殖，形成六边形的单层细胞并含有特征性的细胞连接。

多种用于离体培养HCECs的培养液已被报导，但实验的结果与供体角膜活力相关，因此Peh等[31]使用成对的供体角膜对比研究，消除供体角膜活力的影响，结果显示使用OptiMEM-I培养液和Ham's F12/M199培养液的HCECs更有活力，能够传三代且表达特征性标志物，而其它培养液中内皮细胞只能传一代或者两代。随着细胞传代的次数增加，内皮细胞形态会向成纤维细胞样改变，最终造成内皮细胞向间充质细胞转分化[32-33]。

Okumura等[34]研究发现在体外培养HCECs时，培养液中加入TGF-β受体选择性抑制剂SB431542后，呈成纤维细胞样改变的内皮细胞数量显著下降。据文献报导，体外培养中HCECs的生长受初始的细胞种植密度影响，当种植密度不理想会导致HCECs饱和状态时的密度减小且增殖能力降低[35]。Peh等[36]研究发现在体外培养时，HCECs接种的最适密度为不少于10 000个/cm2。

2.角膜内皮前体细胞增殖培养：Yokoo等[37]研究发现位于周边部的HCECs的增殖能力较强，周边部的内皮细胞有祖细胞或干细胞样特性，可以向中央部提供内皮细胞，可能是HCECs的前体细胞，可通过克隆培养方法在体外扩增。从HCECs分离出前体细胞的克隆球有优先自我更新能力，通过克隆球得到的HCECs可以成功培养出具有功能性的HCECs系[28]。使用克隆形成试验分离得到的前体细胞与原始细胞相比，富集的前体细胞含有更长的端粒、更有活性的端粒酶和更有活力的子代[38]。因此，可以通过克隆形成试验筛选得到年轻的内皮前体细胞进行扩增培养。

四、干细胞诱导分化为角膜内皮细胞

诱导干细胞或多潜能干细胞等分化成角膜内皮细胞为HCECs再生的研究开辟了新方向。

1.角膜内皮细胞干细胞/祖细胞：近年来，有研究认为角膜内皮也可能存在有干细胞或祖细胞。Lgr5激酶是Wnt信号通路的靶目标，是老鼠的肠、胃和毛囊等干细胞的标记物[39-41]，因此Lgr5阳性可以证明细胞具有某些干细胞/祖细胞特性。Hirata-Tominaga等[42]研究发现Lgr5在人角膜周边内皮有特异性表达，且细胞中Lgr5的持续表达能通过Wnt信号通路保持内皮细胞的形态和抑制向间叶细胞转化，由此推断Lgr5可能对于保持HCECs的完整性也有作用。角膜内皮细胞Lgr5的表达证实HCECs有某些干细胞/祖细胞的特性，且LGR5的表达量与HCECs的增殖能力呈正相关。不仅如此，在人角膜边缘部的小梁网与角膜内皮边缘部（包括Schwalbe线）之间也发现存在已知的干细胞标记物。McGowan等[43]研究发现损伤后的角膜会表达额外的干细胞标记物Oct-3/4和Wnt-1与分化标记物Pax-6和Sox-2，其中Pax-6和Sox-2在角膜内皮边缘部也表达。由此表明，可能有角膜内皮干细胞存在于角膜后部边缘部且参与角膜损伤中初始的内皮细胞损伤修复，也参与正常HCECs的缓慢替代过程。

2.胚胎干细胞：由于人胚胎干细胞的获取受到伦理学的约束，所以相关研究很有限。Lu等[44]使用老鼠胚胎干细胞条件培养液(embryonic stem cell conditioned medium,ESC-CM)诱导培养离体HCECs，研究发现使用含有25﹪ESC-CM的培养液能够显著增加人角膜内皮增殖细胞的数量，可能与抑制p21的表达和细胞凋亡有关。

3.多潜能干细胞：骨髓来源的内皮祖细胞（bone marrow-derived endothelial progenitor cells,BEPCs）能够在体外诱导分化为角膜内皮样细胞，诱导后BEPCs的特性有助于修补角膜内皮层的功能障碍[45]。而使用骨髓来源的间充质干细胞条件培养液诱导HCECs，可以调节细胞周期蛋白G1，从而刺激HCECs增殖且保持内皮细胞的特征性形态[46]。以上研究成果为多潜能干细胞分化为HCECs的研究提供了新思路。

4.诱导多能干细胞：诱导多能干细胞(induced pluripotent stem cells,iPSCs)具有类似胚胎干细胞的分化能力，可以分化为全身各种类型的体细胞，同时不会引起伦理学问题和免疫排斥反应，因此iPSCs有可能作为组织工程角膜内皮重建的种子细胞。Zhao等[47]将iPSCs与HCECs共培养，发现在形态学上iPSCs向HCECs方向转化。iPSCs作为HCECs移植疗法中潜在的种子细胞，证实其是否能分化为HCECs仍然有待进一步研究。

五、问题与展望

虽然对HCECs增殖能力和再生机制仍在不断探索，HCECs体外培养扩增技术也不断地完善，但目前仍存在许多问题，譬如HCECs体外培养增殖有限、生长因子等的促增殖作用还不明确、尚未找到理想的干细胞和替代细胞、再生细胞的特性和功能与正常HCECs仍有差距等等。要解决这些问题，有必要对HCECs生理功能和再生能力的相关理论做反复验证，并且从分子水平和基因层面进一步研究调控HCECs增殖的机制，为今后角膜内皮细胞失代偿的治疗提供新方向。

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Research progress on corneal endothelial cells regeneration

Zhu Mengyu,Shao Chunyi,Fu Yao.Department of Ophthalmology,Ninth people’s Hospital,Shanghai Jiaotong University School of Medicine,Shanghai 200011,China

Fu Yao,Email: fuyaofy@sina.com

Human corneal endothelial cells play a key role in maintaining corneal transparency.Division of the cells cease and arrest in G1 phase when cell-cell contact formed,but they don’t exit the cell cycle.There are many factors involved in corneal endothelial cell proliferation,TGF- β2 inhibits human corneal endothelial cells into the S phase of the cell cycle,whereas EGF,FGF,NGF can promote cell proliferation; ROCK inhibitor Y-27632 can promote adhesion of endothelial cells.Culture of corneal endothelial precursor cells,and inducing pluripotent stem cells into corneal endothelial cell may provide a new method for the treatment of corneal endothelial dysfunction.

Cornea；Endothelial cells；Cell cycle；Cell proliferation；Stem cell

2014-02-10)

（本文编辑：蔡晓珍）

10.3877/cma.j.issn.2095-1221.2014.02.007

国家自然科学基金（81370992、81000366、31000443）；市科委基础研究重点项目连续支持项目（11JC1407000）；上海市浦江人才计划（12PJD025）；上海交通大学医学院博士创新基金项目（BXJ201227）

200011 上海，上海交通大学医学院附属第九人民医院眼科

傅瑶，Email：fuyaofy@sina.com

朱梦玉,邵春益,傅瑶.角膜内皮细胞再生研究新进展[J/CD].中华细胞与干细胞杂志:电子版,2014,4(2):116-121.