贺建超，贺聪莹，卢美欢，马英辉，王玛丽

(1.陕西省微生物研究所，陕西 西安 710043；2.西北大学生命科学学院，陕西 西安 710069)

〈育种与驯化〉

双孢蘑菇和姬松茸灭活原生质体融合育种研究

贺建超1，贺聪莹2，卢美欢1，马英辉1，王玛丽2

(1.陕西省微生物研究所，陕西 西安 710043；2.西北大学生命科学学院，陕西 西安 710069)

以双孢蘑菇和姬松茸为亲本菌株，通过灭活原生质体融合，经过初筛和复筛，1株新的稳定的双孢蘑菇和姬松茸杂交高产菌株被选育出来。双孢蘑菇原生质体被热灭活(65℃，30 min)，姬松茸原生质体被紫外线灭活(30 w，30 cm，10 min)，双亲存活率为3.1×10-7～3.3×10-8。在聚乙二醇诱导下融合继续生存，亲本原生质体融合被实现，重组频率为4.8×10-5。

双孢蘑菇；姬松茸；灭活原生质体；融合；重组子

自从1977年以来，人们开始了用灭活原生质体进行微生物融合育种的尝试[1]。双孢蘑菇和姬松茸同是蘑菇属不同种间的食用菌，为了将它们的优良特性结合在一起，人工创造新品种，采用灭活原生质体融合技术，经过多年的研究，得到了双孢蘑菇和姬松茸融合重组子。对融合重组子进行了多代选育，获得了性状稳定的高产优质杂交新菌株。现将研究结果报道如下。

1 材料与方法

1.1 供试菌株

双孢蘑菇(Agaricusbisporus)2796-1、姬松茸(Agaricusblazei)M1，均系陕西省微生物研究所保藏菌株。

1.2 供试培养基

综合PDA 培养基：土豆200 g、蛋白胨2 g、酵母膏2 g、硫酸镁0.5 g、磷酸二氢钾0.5 g、磷酸氢二钾1 g、葡萄糖20 g、维生素B110 mg、琼脂粉20 g，蒸馏水 1 000 mL；再生培养基(RM)：综合PDA培养基加入甘露醇0.6 mol；液体再生培养基(LRM)：综合PDA培养基不加琼脂粉，另外加入硫酸镁0.6 mol。

1.3 混合酶液

中科院生物物理所生产的蜗牛酶10 mg·mL-1，中科院上海生化所生产的纤维素酶10 mg·mL-1，用0.6 mol硫酸镁作等渗液，pH5.8磷酸盐缓冲液配制。酶溶解后 5 000 r·min-1，离心10 min去掉沉淀杂质，上清液再用灭菌G6漏斗过滤除菌。

1.4 融合剂

用0.6 mol硫酸镁和0.01 mol氯化钙配制的30%聚乙二醇(PEG)，分子量为 6 000D(日本进口分装)。灭菌备用。

1.5 原生质体的分离与再生

收集25℃三角瓶液体培养6 d～8 d菌丝体1 g，加10 mL混合酶液轻微震荡，在小三角瓶中酶解脱壁。30℃水浴酶解4 h，原生质体产量达到最高峰。G3漏斗过滤残余菌丝体，用0.6 mol·L-1硫酸镁洗涤2次，收集原生质体悬浮液20 mL。用血球计数器计数，双孢蘑菇原生质体浓度为3.6×108个·mL-1，姬松茸原生质体浓度为3.4×108个·mL-1。

将制备的原生质体悬浮液分别用液体再生培养基和无菌水稀释，25℃预培养24 h，取0.1 mL涂布于再生平板培养基上，25℃培养8 d～10 d，两者菌落数之差，除以显微计数原生质体数，即为原生质体再生频率。双孢蘑菇和姬松茸原生质体再生频率分别为2.4%和2.1%[2]。

1.6 原生质体灭活与融合

取双孢蘑菇原生质体悬浮液10 mL，65℃水浴灭活30 min，检测存活率为3.1×10-7；取姬松茸原生质体悬浮液10 mL倒入直径20 cm 无菌平皿中，在30 W紫外灯管正下方30 cm 处，打开皿盖照射灭活处理10 min，检测存活率为3.3×10-8。

将两亲株灭活的原生质体各取1 mL混合到无菌带塞的离心管内，加入1 mL 30℃预热的聚乙二醇，2 000 r·min-1离心20 min，30℃温浴10 min，以5 mL 0.6 mol·L-1硫酸镁洗涤2次，再用液体再生培养基作系列稀释，25℃预培养24 h，取0.1 mL 涂布平板再生培养基，25℃继续培养8 d～10 d，挑选融合重组子再生菌株60株，移接于综合PDA斜面培养基上，25℃培养满管，4℃冰箱保存备用[3]。

2 结果与分析

2.1 灭活原生质体融合频率

双孢蘑菇2796-1和姬松茸M1原生质体分别采用热灭活和紫外线灭活法处理，混合后在聚乙二醇诱导下发生融合，融合后重组频率为4.8×10-5。

2.2 融合重组子鉴定

拮抗作用：在60株融合子中有85%的菌株与双亲菌株形成了明显的拮抗线，融合子之间也有拮抗但不明显。

出菇试验：双孢蘑菇2796-1和姬松茸M1融合子从F1～F3代性状分离，其规律不同于孟德尔分离规律[2]。取典型的双亲性状的子实体做组织分离，进行纯化培养。继续栽培6次，观察选择获得了性状稳定的双孢蘑菇和姬松茸杂交高产优质新菌株。新菌株菌丝洁白粗壮，生长速度快。子实体形态和颜色介于两亲本之间，麦草牛粪发酵培养料栽培周期为6个月，每千克干料可产鲜蘑菇0.54 kg。有显著的杂交优势，抗杂菌能力超过双亲菌株。

2.3 融合重组子分析

双孢蘑菇和姬松茸采用灭活原生质体融合技术可以获得理想的杂交新菌株。选择亲缘关系较远，且具有互补优势的菌株为亲本，有利于杂交优势的体现[4]。双亲灭活原生质体融合的特点是可以省去遗传标记菌株的筛选，还有利于排除双方亲本类型的再生菌株的干扰，便于选择融合重组子。热灭活必须配合其它灭活方式，双亲菌株原生质体均用热灭活法处理，致死损伤部位都一样，融合后得不到互补，就得不到融合子再生菌株。双亲菌株原生质体均用紫外线灭活法处理。又会通过UV处理在不同位点上损伤DNA，因而有可能使融合子的某些代谢途径受到干扰，或许影响产量。但它可以刺激双亲菌株基因组间的交换，这是紫外线灭活法的优点。因此，我们选用了双孢蘑菇原生质体热灭活，姬松茸原生质体紫外线灭活，融合后双方原生质体损伤部位得到互补，我们就很容易从再生平板上，挑选出融合子再生菌株。

[1]周东坡，平文祥. 微生物原生质体融合[M]. 哈尔滨：黑龙江科学技术出版社，1990：301-304.

[2]刘振岳，泰立芳，张伟. 细胞工程株平香1号培育简报[J]. 食用菌，1995(6)：7-8.

[3]贺建超，贺榆霞. 木耳灭活原生质体融合育种研究[J]. 中国食用菌，2003，22(5)：16-17.

[4]张树庭，林方灿. 蕈菌遗传与育种[M]. 北京：中国农业出版社，1997：96.

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Study on the Breeding ofAgaricusbisporusandAgaricusblazeiby Inactivated Protoplast Fusion

HE Jian-chao1, HE Cong-ying2, LU Mei-huan1, MA Ying-hui1, WANG Ma-li2

(1.Shaanxi Institute of Microbiology, Xi’an Shanxi 710043; 2.College of Life Science, Northwest University, Xi’an Shanxi 710069)

In this study, a new steady, high-yield strain was obtained by inactivated protoplast fusion of the parent strain ofAgaricusbisporusandAgaricusblazeithrough primary and secondary screening.AgaricusbisporusandAgaricusblazeiprotoplast was inactivated with heating (65℃, 30 min) and UV light (30 w, 30 cm, 10 min) respectively. The livability of both was about 3.1×10-7～3.3×10-8. By the inducer of polyethylene glycol, the parent protoplast fusion was carried out with a recombination freguency of 4.8×10-5.

Agaricusbisporus;Agaricusblazei; Inactivated protoplasts; Fusion; Recon

贺建超(1963-)，男，副研究员，长期从事食用菌遗传育种工作。

2013-11-16

S646.9

A

1003-8310(2014)01-0009-02