石园园 综述 杨向群 审校

·综述·

脂肪源性干细胞向心肌细胞诱导分化的研究进展

石园园 综述 杨向群 审校

脂肪源性干细胞因具有生物学特性稳定、来源广泛、取材方便、数量充足、易于培养扩增的优点，且在特定的诱导条件下可以分化为心肌细胞，有望成为细胞治疗的理想来源。诱导方法的选择，影响分化因素的研究已成为了细胞治疗领域研究的热点。本文就脂肪源性干细胞向心肌细胞诱导分化的方法和机制的研究进展进行综述。

脂肪源性干细胞诱导心肌细胞分化

2001年，Zuk等[1]首次从脂肪组织中成功分离出脂肪源性干细胞（Adipose-derived stem cells，ASCs），发现其具有多向分化潜能，在特异性诱导因子的作用下，可以向特定类型的细胞分化[2]。随后，Rangappa等[3]首次证实了腹部皮下白色脂肪的ASCs在5-氮胞苷（5-azacytidine，5-AZA）的诱导下可向心肌细胞分化。心肌细胞的再生能力低下，不能够有效补充大面积心肌梗死所造成的心肌细胞丢失，致使梗死部位瘢痕形成及心肌收缩力降低和电传导系统改变。近年来，细胞治疗已经作为一种新的疗法被应用于心肌梗死后的修复。研究表明，植入心肌损伤模型的ASCs可能通过在梗死区分化为大量心肌细胞，或旁分泌方式刺激血管新生等机制来改善心肌的功能[4]。相比于其他干细胞，如胚胎干细胞、骨髓间充质干细胞等，ASCs具有生物学特性稳定、来源广泛、取材方便、数量充足且易于培养扩增的优点，有望成为细胞治疗的理想来源[5]。诱导ASCs向心肌细胞定向分化已成为细胞治疗研究领域的热点。现就ASCs向心肌细胞诱导分化的方法和机制进行综述。

1 体外诱导ASCs向心肌细胞分化的方法及机制

1.1 5-AZA诱导法

继1999年Makino等[6]首次将5-AZA应用于骨髓间充质干细胞（Bone mesenchymal stem cell,BMSCs）向心肌细胞的诱导分化之后，5-AZA被广泛应用于诱导多种细胞向心肌细胞的分化，包括胚胎干细胞、P19细胞以及ASCs等。5-AZA是一种DNA甲基转移酶抑制剂。DNA的甲基化与基因的表达、染色体的修饰和失活、基因组印迹和内源性的基因沉默相关[7]。干细胞多能性及自我更新能力的保持也与DNA的甲基化密切相关。与细胞分化相关的基因在低甲基化时被激活，高甲基化时被抑制[8]。5-AZA有可能通过去甲基化作用激活ASCs对α-重链肌球蛋白、β-重链肌球蛋白、肌钙蛋白、GATA-4、肌球蛋白轻链（Myosin light chain，MLC-2v）、连接蛋白43及心钠素等心肌特异性基因的表达。

Rangappa等[3]使用免疫荧光检测到了分化细胞对肌球蛋白重链、肌动蛋白及肌钙蛋白I（Cardiac troponin T，cTnT）的表达，并认为5-AZA会诱导ASCs进入快速增殖的不稳定状态，一旦耗尽增殖潜能，这些瞬间增多的干细胞就会退出增殖周期，变成终末分化的心肌细胞，并转变其端粒末端转移酶基因。2005年，Strem等[9]使用相同的方法成功诱导了鼠腹股沟来源的ASCs向心肌细胞的分化，并通过RT-PCR分析显示出了分化细胞对MLC-2v、GATA-4、α-重链肌球蛋白及β-重链肌球蛋白等心肌特异性标志表达的上调。Carvalho等[10]在所有的分化细胞中均检测到了横纹肌肌动蛋白和连接蛋白43的表达。

虽然在很多的研究中5-AZA都成功诱导了ASCs向心肌细胞的分化，但是这些ASCs大多是鼠或兔来源的，在对hASCs诱导分化的研究中，5-AZA的诱导作用是存在争议的。Lee等[11]使用5-AZA诱导处理人腹部皮下白色脂肪的ASCs，既没有观察到自主跳动的细胞，也没有检测到心肌细胞特异性标志的表达，认为单纯的5-AZA不足以诱导hASCs向心肌细胞的分化。2010年，Choi等[12]报道5-AZA诱导hASCs向心肌细胞的分化具有传代的限制性，仅在第4代hASCs分化来的细胞上检测到了心肌特异性标志Nkx2.5、肌钙蛋白Ⅰ和α-辅肌动蛋白的表达。通过对ASCs启动子上的一段长2.5 Kb区域的检测，发现大部分心肌特异性基因并没有被甲基化，ASCs向心肌细胞分化的潜能并没有被启动子的甲基化所阻断，这些启动子并不直接被5-AZA的去甲基化影响。随后，有研究报道，使用5-AZA诱导第5代和第10代的hASCs，也仅观察到分化细胞形成肌管样结构，而且定量PCR分析显示，分化细胞中大部分心源性基因的表达是下调的[13]。

此外，关于5-AZA的诱导条件也存在一定争议。首先是5-AZA的使用浓度，Rangappa等[3]发现9 μmol/L的5-AZA诱导结果最佳；Martin-Rendon等[14]报道5 μmol/L或10 μmol/L的5-AZA诱导结果并没有明显差别；还有研究表明，3 μmol/L的5-AZA已经足以诱导ASCs向心肌细胞的分化[15-16]。其次是诱导时长，大多研究支持24 h是最佳的诱导时间[3，11，14]。增加诱导处理时间并不能提高ASCs向心肌细胞分化的转化率，过长或反复诱导则可能会增强5-AZA对细胞的遗传毒性，诱发细胞凋亡[9，12]。

1.2 心肌细胞提取液诱导法

研究发现，在体外，一种成体细胞的提取液可能通过促进细胞核摄入转录调节因子和诱导染色体重建等机制，改变另一种细胞的分化方向[17-18]。2004年，Gaustad等[19]使用大鼠心肌细胞质核提取液，成功地诱导了第4代hASCs向心肌细胞分化，免疫荧光检测到部分分化细胞横纹肌肌动蛋白、缝隙连接蛋白43等心肌特异性标志的表达。该研究认为，ASCs可能通过摄取提取液中的分化因子，改变了核内染色体的结构，从而诱导被抑制基因的表达，但是在ASCs的表面并没有检测到相关的受体结构。提取液加热后对ASCs的诱导分化作用会消失，提示诱导作用可能和热不稳定蛋白相关。研究发现，小的非编码核RNA也可能与细胞的分化或基因的重组有关[20-21]。Perán等[22]使用人心房细胞的质核提取液诱导hASCs，发现诱导组细胞的活性仅为对照组细胞的15%～20%，免疫印迹分析显示，存活的分化细胞中有73%～80%都能表达心肌细胞标志，包括横纹肌肌动蛋白、cTnT、cTnI、连接蛋白43及结蛋白等，并呈现出形态上的特征性变化，包括体积的增大、纤维样变和双核变等。RT-PCR检测到的心肌相关性基因，也进一步证实了免疫印迹分析的结果。

1.3 甲基纤维素培养基诱导法

2004年，Planat-Bénard等[23]首次证实了取自鼠腹股沟和肩胛部的ASCs可以自发地分化为心肌细胞。分化细胞间存在紧密连接，并形成了肌管样结构。GATA-4、Nkx2.5、心室和心房MLC-2v和MLC-2a等心源性基因及分泌物心房钠尿肽（Atrial natriuretic peptide，ANP）的检测均为阳性。相关的机制尚未清楚，但目前有许多研究认为细胞因子和化学诱导剂对这种分化具有促进作用。Song等[24]发现，血管内皮生长因子（Vascular endothelial growth factor，VEGF）可能通过旁分泌机制促进这种分化。在培养基中添加VEGF可以显著增加α-MHC、cTnI和Nkx2.5的表达，抗VEGF抗体则可以阻断cTnT的表达。Palpant等[25]使用相似的培养基培养取自小鼠肩胛区的ASCs，也得到了一致的结果。蛋白质印迹分析显示出cTnI的蛋白质亚型从慢骨骼肌肌钙蛋白Ⅰ向成体心肌肌钙蛋白Ⅰ的演变过程，进一步证实了ASCs具有分化并发育为成熟心肌细胞的潜能。该研究还发现，重组Wnt蛋白也可通过影响细胞的信号转导通路，来促进ASCs向心肌细胞的分化。但有研究认为，这些结果可能只是由于心肌蛋白的被动吸收或外源性因子诱导的暂时性转录，而非ASCs的真正分化[11]。

1.4 与心肌细胞共培养法

2010年，Choi等[12]分别使用直接接触共培养法和间接接触共培养法，来培养hASCs和新生鼠的心肌细胞。直接接触共培养法成功诱导了hASCs向心肌细胞的分化，RT-PCR检测发现，分化细胞对人心肌肌动蛋白mRNA的表达具有时间依赖性。间接接触培养组却没有检测到人心肌肌动蛋白mRNA水平的显著变化。该研究认为，细胞的直接接触是诱导ASCs分化的关键，可能存在3种机制：①邻近的鼠心肌细胞的机械性伸长；②通过细胞膜接触的潜在性的电信号传导；③融合因子通过缝隙连接从鼠心肌细胞传递至ASCs。同年，Jin等[26]将鼠ASCs与新生鼠的心肌细胞进行间接接触培养，得出了相同的结果。但在加入淫羊藿甙（Icaria，ICA）的间接接触培养组，却检测到了分化细胞对心肌特异性基因，包括转录因子Nkx2.5、GATA-4、MLC-2v、α-横纹肌肌动蛋白和cTnT等的表达。研究发现，ICA可通过信号调节蛋白激酶（Extracellular signal-regulated kinase，ERK）信号转导通路对细胞的生长和分化进行调节[27-31]。EPK的抑制剂PD98059可以部分抑制ICA的诱导作用。对细胞周期的调节作用可能是其介导分化的关键所在，但并不是唯一的作用机制，肿瘤抑制基因也可能与之相关。随后，Cai等[32]的研究再次证实了直接接触共培养法诱导ASCs向心肌细胞分化的作用。该研究还发现，移植前在体外进行ASCs与心肌细胞的共培养处理可以提高体内分化细胞的cTnT表达阳性率。Behfar等[33]的报道同样表明，在慢性心肌损伤模型上移植经共培养处理过的ASCs，对心肌功能和结构的改善都要优于直接注射自然状态下的ASCs。虽然其中的机制仍不清楚，但是与心肌细胞共培养可以形成一个相似于心脏的微环境，心肌细胞也可以通过分泌细胞因子、激素或一些可溶性因子调节信号通路从而诱导ASCs向心肌细胞的分化。

2 分化细胞的收缩或自主搏动现象

在一些诱导ASCs向心肌细胞分化的研究中，不仅检测到了心肌特异性标志的表达，还观察到了分化细胞的收缩活动或自主搏动现象。这种现象的发生机制尚未研究清楚，但可能与诱导方法的选择或ASCs的组织来源相关。研究表明，上述诱导方法均有可能诱导ASCs分化为收缩或自主搏动的心肌细胞。但同一种方法中诱导物浓度或诱导时间的差异可能导致结果的不同。在5-AZA诱导法中，仅有Rangappa等[3]在培养的第3周观察到了分化细胞的自主搏动，实验过程中用到的是9 μmol/L的5-AZA，诱导时长24 h。Gaustad等[19]使用4～6周龄的大鼠心肌细胞提取液，成功诱导了hASCs向自主搏动的心肌细胞分化。其他使用人心肌细胞提取液或新生鼠细胞提取液的研究中，均没有观察到收缩或自主搏动现象。甲基纤维素培养基法诱导的分化细胞均发生了收缩[23-25]。Choi等[12]的研究中使用hASCs与新生鼠心肌细胞直接接触共培养法，诱导的分化细胞也发生了自主搏动。脂肪组织分为棕色脂肪和白色脂肪，动物肩胛区和腹股沟处的脂肪组织中均含有棕色脂肪成分。有研究报道，棕色脂肪来源的ASCs具有较高的成心肌分化能力，且可在体外自发分化为有功能的心肌细胞[34]。上述甲基纤维素培养基法诱导实验中的ASCs均来源于小鼠的腹股沟和肩胛部位，而另外三种方法中分化为能自主搏动心肌细胞的ASCs均来自于白色脂肪组织。此外，Choi等[12]还认为，分化细胞的收缩能力取决于接种细胞的密度，当细胞密度小于5×104时，细胞间距过大，可导致细胞不能收缩。

关于自主搏动的分化细胞是否是起搏细胞也需要进一步的研究证实。从起搏细胞的定义出发，这些分化细胞能够自动产生节律性兴奋，发生自主搏动，就应该是起搏细胞。Planat-Bénard等[23]对分化细胞进行超微结构的分析，认为这些分化细胞有可能是心室肌细胞（MLC-2a和连接蛋白43阳性）、心房肌细胞（MCL-2a、ANP和连接蛋白40阳性）及起搏细胞（介导自主收缩）的混合。该研究通过电流钳检测到了细胞的自发膜电位变化，药物试验发现分化细胞可以对肾上腺素能和胆碱能药物作出相适应的反应，这些证据进一步证实了起搏细胞的存在。Palpant等[25]使用指示剂FURA2AM处理分化细胞，检测到了与细胞收缩相一致的钙瞬变。Choi等[12]也同样检测到了钙瞬变，并发现分化细胞的钙瞬变和收缩节律与周围的大鼠心肌细胞相一致。该研究还通过细胞标记的方法，证实了分化细胞与鼠心肌细胞间缝隙连接的存在。缝隙连接允许心肌细胞间的电偶联，形成细胞间电兴奋波（同步收缩的基础）的传导通路[35]，来自收缩的鼠心肌细胞的电刺激可能在诱导ASCs向心肌细胞分化的过程中起到了重要作用。

3 问题和展望

随着人们对ASCs生物学特性认识的加深，以及生物实验技术的发展，ASCs在未来干细胞治疗中的临床应用将具备无限可能。但是，现阶段ASCs的诱导方法还存在很大的缺陷，几乎所有的诱导结果都存在着低转化率的问题；在共培养诱导法中，异种细胞间会存在免疫排斥作用，应用到临床上时将会需要大量的自体心肌细胞，而这对于经历过心衰的患者几乎是不可能的。诱导和分化的机制也待更深层次的研究和探讨，使用心肌细胞提取液或甲基纤维素培养基诱导时诱导物的最终去向，以及分化细胞的功能是否持久及其持续时长都不清楚。分化细胞起搏特性的验证，也将会对生物起搏器的研制产生深远的影响。

[1]Zuk PA,Zhu M,Mizuno H,et al.Multilineage cells from human adipose tissue:implications for cell-based therapies[J].Tissue Eng,2001,7(2):211-228.

[2]Zuk PA,Zhu M,Ashjian P,et al.Human adipose tissue is a source of multipotent stem cells[J].Mol Biol Cell,2002,13(12): 4279-4295.

[3]Rangappa S,Fen C,Lee EH,et al.Transformation of adult mesenchymal stem cells isolated from the fatty tissue into cardiomyocytes[J].Ann Thorac Surg,2003,75(3):775-779.

[4]Pinheiro CH,de Queiroz JC,Guimaràes-Ferreira L,et al.Local injections of adipose-derived mesenchymal stem cells modulate inflammation and increase angiogenesis ameliorating the dystrophic phenotype in dystrophin-deficient skeletal muscle[J].Stem Cell Rev,2012,8(2):363-374.

[5]Zuk PA.The adipose-derived stem cell:looking back and looking ahead[J].Mol Biol Cell,2010,21(11):1783-1787.

[6]Makino S,Fukuda K,Miyoshi S,et al.Cardiomyocytes can be generated from marrow stromal cells in vitro[J].J Clin Invest,1999, 103(5):697-705.

[7]Sulewska A,Niklinska W,Kozlowski M,et al.DNA methylation in states of cell physiology and pathology[J].Folia Histochem Cytobiol,2007,45(3):149-158.

[8]Fouse SD,Shen Y,Pellegrini M,et al.Promoter CpG methylation contributes to ES cell gene regulation in parallel with Oct4/Nanog, PcG complex,and histone H3 K4/K27 trimethylation[J].Cell Stem Cell,2008,2(2):160-169.

[9]Strem BM,Zhu M,Alfonso Z,et al.Expression of cardiomyocytic markers on adipose tissue-derived cells in a murine model of acute myocardial injury[J].Cytotherapy,2005,7(3):282-291.

[10]Carvalho PH,Daibert AP,Monteiro BS,et al.Differentiation of adipose tissue-derived mesenchymal stem cells into cardiomyocytes [J].Arq Bras Cardiol,2013,100(1):82-89.

[11]Lee WC,Sepulveda JL,Rubin JP,et al.Cardiomyogenic differentiation potential of human adipose precursor cells[J].Int J Cardiol, 2009,133(3):399-401.

[12]Choi YS,Dusting GJ,Stubbs S,et al.Differentiation of human adipose-derived stem cells into beating cardiomyocytes[J].J Cell Mol Med,2010,14(4):878-889.

[13]Wan Safwani WK,Makpol S,Sathapan S,et al.5-Azacytidine is insufficient for cardiogenesis in human adipose-derived stem cells [J].J Negat Results Biomed,2012,11:3.

[14]Martin-Rendon E,Sweeney D,Lu F,et al.5-Azacytidine-treated human mesenchymal stem/progenitor cells derived from umbilical cord,cord blood and bone marrow do not generate cardiomyocytes in vitro at high frequencies[J].Vox Sang,2008,95(2):137-148.

[15]Fukuda K.Reprogramming of bone marrow mesenchymal stem cells into cardiomyocytes[J].C R Biol,2002,325(10):1027-1038.

[16]Haghani K,Bakhtiyari S,Nouri AM.In vitro study of the differentiation of bone marrow stromal cells into cardiomyocyte-like cells[J].Mol Cell Biochem,2012,361(1-2):315-320.

[17]Landsverk HB,H?kelien AM,Küntziger T,et al.Reprogrammed gene expression in a somatic cell-free extract[J].EMBO Rep, 2002,3(4):384-389.

[18]Hakelien AM,Landsverk HB,Robl JM,et al.Reprogramming fibroblasts to express T-cell functions using cell extracts[J].Nat Biotechnol,2002,20(5):460-466.

[19]Gaustad KG,Boquest AC,Anderson BE,et al.Differentiation of human adipose tissue stem cells using extracts of rat cardiomyocytes [J].Biochem Biophys Res Commun,2004,314(2):420-427.

[20]Maison C,Bailly D,Peters AH,et al.Higher-order structure in pericentric heterochromatin involves a distinct pattern of histone modification and an RNA component[J].Nat Genet,2002,30(3): 329-334.

[21]Sleutels F,Zwart R,Barlow DP.The non-coding Air RNA is required for silencing autosomal imprinted genes[J].Nature, 2002,415(6873):810-813.

[22]Perán M,Marchal JA,López E,et al.Human cardiac tissue induces transdifferentiation of adult stem cells towards cardiomyocytes[J]. Cytotherapy,2010,12(3):332-337.

[23]Planat-Bénard V,Menard C,André M,et al.Spontaneous cardiomyocyte differentiation from adipose tissue stroma cells[J]. Circ Res,2004,94(2):223-229.

[24]Song YH,Gehmert S,Sadat S,et al.VEGF is critical for spontaneous differentiation of stem cells into cardiomyocytes[J].Biochem Biophys Res Commun,2007,354(4):999-1003.

[25]Palpant NJ,Yasuda S,MacDougald O,et al.Non-canonical Wnt signaling enhances differentiation of Sca1+/c-kit+adipose-derived murine stromal vascular cells into spontaneously beating cardiac myocytes[J].J Mol Cell Cardiol,2007,43(3):362-370.

[26]Jin MS,Shi S,Zhang Y,et al.Icariin-mediated differentiation of mouse adipose-derived stem cells into cardiomyocytes[J].Mol Cell Biochem,2010,344(1-2):1-9.

[27]Zhu D,Qu L,Zhang X,et al.Icariin-mediated modulation of cell cycle and p53 during cardiomyocyte differentiation in embryonic stem cells[J].Eur J Pharmacol,2005,514(2-3):99-110.

[28]Valiunas V,Doronin S,Valiuniene L,et al.Human mesenchymal stem cells make cardiac connexins and form functional gap junctions [J].J Physiol,2004,555(Pt 3):617-626.

[29]Valiunas V,Weingart R,Brink PR.Formation of heterotypic gap junction channels by connexins 40 and 43[J].Circ Res,2000,86 (2):e42-e49.

[30]Yun DH,Song HY,Lee MJ,et al.Thromboxane A(2)modulates migration,proliferation,and differentiation of adipose tissue-derived mesenchymal stem cells[J].Exp Mol Med,2009,41(1):17-24.

[31]Boheler KR,Czyz J,Tweedie D,et al.Differentiation of pluripotent embryonic stem cells into cardiomyocytes[J].Circ Res,2002,91 (3):189-201.

[32]Cai A,Zheng D,Dong Y,et al.Efficacy of Atorvastatin combined with adipose-derived mesenchymal stem cell transplantation on cardiac function in rats with acute myocardial infarction[J].Acta Biochim Biophys Sin(Shanghai),2011,43(11):857-866.

[33]Behfar A,Yamada S,Crespo-Diaz R,et al.Guided cardiopoiesis enhances therapeutic benefit of bone marrow human mesenchymal stem cells in chronic myocardial infarction[J].J Am Coll Cardiol, 2010,56(9):721-734.

[34]Yamada Y,Wang XD,Yokoyama S,et al.Cardiac progenitor cells in brown adipose tissue repaired damaged myocardium[J]. Biochem Biophys Res Commun,2006,342(2):662-670.

[35]Iezzi S,Cossu G,Nervi C,et al.Stage-specific modulation of skeletal myogenesis by inhibitors of nuclear deacetylases[J].Proc Natl Acad Sci U S A,2002,99(11):7757-7762.

Differentiation of Adipose-derived Stem Cells into Cardiomyocytes

SHI Yuanyuan1,YANG Xiangqun2.

1 Company 2 of Clinical Medicine;Second Military Medical University,Shanghai 200433,China;2 Department of Human Anatomy, Research Center of Regenerative Medicine,Second Military Medical University,Shanghai 200433,China.Corresponding author:YANG Xiangqun(E-mail:yangxgq@smmu.edu.cn).

【Summary】The use of stem cells in the treatment of myocardial infarct has been strongly pursued in recent years.Due to their availability,feasibility,plasticity,and their potential to differentiate into cardiomyocytes at specific media,adiposederived stem cells(ASCs)have become an ideal source of donor cells.A significant effort has gone into elucidating which factors and techniques influence this differentiation.The methods and mechanisms of differentiation of ASCs into cardiomyocytes were reviewed in this paper.

Adult mesenchymal stem cells;Induction;Cardiomyocytes;Differentiation

Q813.1+1

B

1673－0364（2014）06－0351－04

2014年3月16日；

2014年5月9日）

10.3969/j.issn.1673-0364.2014.06.014

国家自然科学基金（31170934）。

200433上海市第二军医大学学员旅学员二队（石园园）；第二军医大学解剖学教研室、再生医学研究中心（杨向群）。

杨向群（E-mail：yangxq@smmu.edu.cn）。