王飞翔 贺慧霞

诱导性多潜能干细胞(induced pluripotent stem cells， iPSC)是Yamanaka 等[1]率先通过逆转录病毒介导， 将Oct3/ 4、Sox2、Klf4 和c-Myc 基因(这4 个基因又称为Yamanaka 因子)转入小鼠成纤维细胞， 诱导其发生重编程后得到的、与胚胎干细胞(embryonic stem cells， ESC)相似的多能干细胞。基于iPSC 的细胞替代治疗不仅可避免ESC来源有限、免疫原性和伦理性这些关键问题， 而且可为多种疑难疾病的个体化治疗带来新的希望，具有深远的科学价值和广泛的应用价值。目前关于iPSC 获取的方法、诱导效率、安全性等正不断完善，iPSC 研究在口腔领域也有较大进展。本文主要就iPSC 技术的发展、口腔组织来源的iPSC 及iPSC 用于口腔组织再生的研究进展做一综述。

1. iPSC技术的发展

从iPSC 技术诞生以来，一直面临着诱导率低，自身安全性不足等问题，目前主要通过选择不同组织来源的细胞、改变培养条件及诱导方法、减少转录因子和改进载体系统等方法来提高iPSC 的诱导率和安全性。

2. 诱导效率方面的发展

2.1 种子细胞来源的选择 不同组织来源的成体细胞诱导为iPSC 的诱导率不同。最初的皮肤成纤维细胞的诱导率仅0.01%[1]。Sun N 等[2]研究发现脂肪组织来源的干细胞重编程为iPSC，其诱导率可达0.2%；羊水来源的细胞诱导为iPSC 的诱导率可达0.5%[3]，脐静脉内皮细胞iPSC 诱导率可达2.5%-3%[4]。另外，相对于已分化的成体细胞，干细胞分化为iPSC 更加容易，而且诱导率较高。但转化效率越高的细胞，越难获得。

2.2 改变培养环境及改进诱导方法 培养环境的氧浓度对iPSC 的诱导效率也有影响。Yoshida Y 等[5]发现把iPSC 培养环境的氧浓度使通常的21%降到5%，iPSC 的生成效率可提高至原来的2.5-4.2 倍。Ban 等[6]利用仙台病毒(Sendai virus)载体，可以使脐带血细胞重编程为iPSC 的诱导率提高0.01%；YU 等[7]使用oriP/ EBNA1 载体重编程体细胞，诱导率可达1%。另外，添加小分子化学物质也可以提高诱导率。Esteban 等[8]研究发现，在培养过程中添加维生素C，可使诱导率提高至6.2%；Huangfu 等[9]发现DNA 甲基化和组蛋白去乙酰化酶抑制剂可提高重编程效率，尤其是丙戊酸钠组蛋白去乙酰化酶抑制剂，可使重编程效率提高100 多倍。而Hong 等[10]去除c－Myc 基因后用siRNA 阻断P53 基因通路，发现也可将皮肤细胞转化为iPSC 的成功率提高至10%左右。

3. 安全性方面的发展

3.1 减少转录因子数量 对大多数体细胞进行重编程时，一般会需要Oct4 及Sox2 两个转录因子，或至少需要Oct4 这一因子。不同的因子组合对不同细胞的重编程效果不同，可根据供体细胞种类及其相应转录因子表达水平灵活选择。如小鼠的神经干细胞和神经前体细胞，其本身高表达Sox2 和c-Myc，因此只用Oct4 和Klf4 两种转录因子，甚至只用Oct4 一个转录因子就可将其重编程为iPSC。这无疑提高了iPSC 的安全性，因c-Myc 基因有致癌性，所以在构建iPSC 时应尽量避免使用。

3.2 载体系统的改进 目前使用的载体系统主要有逆转录病毒载体、慢病毒载体、腺病毒载体、质粒载体、脂质体载体和非整合型附着体载体等。早期的iPSC 诱导主要采用逆转录病毒或慢病毒等载体，病毒介导的转基因方式可实现目标基因稳定表达，但病毒载体存在整合入宿主细胞基因组并导致肿瘤的问题，因此其安全性难以满足需要。腺病毒载体整合进细胞基因组中的可能性较小，易于获得无毒害副作用的或无病毒载体整合的iPSC，但诱导效率较逆转录病毒和慢病毒方法低得多。Okita 等[11]使用质粒载体，通过一个多顺反子载体上的Oct4、Klf4、Sox2 及一个单独质粒上的c-Myc，反复转染小鼠胚胎成纤维细胞获得iPSC，完全避免了使用病毒载体。Okita 等[11]还通过脂质体介导Yamanaka 因子获得没有外源基因插入的iPSC，但这种方法需反复转染细胞且重编程效率很低，且不能完全避免表达载体整合入基因组中。Yu[7]等使用oriP／EBNA1 两个元件的非整合型附着体载体携带Oct4、Sox2、Nanog、Lin28，将人成纤维细胞诱导为iPSC。载体系统的不断改进虽然一定程度上提高了iPSC 的安全性，但与此同时细胞重编程效率也随之降低。所以，如何在提高iPSC 安全性的同时也提高诱导效率是一个重要问题。

4. 口腔组织来源的iPSC及在全身疾病中的应用

4.1 牙龈来源的iPSC 牙龈是一种较容易获得的组织，一般的牙科治疗中常有切除牙龈，如果能将在牙龈中获取的细胞成功诱导成iPSC，这将避免患者因取皮肤等组织引起的额外创伤。2010年，Yatani 等[12]通过引入4 个转录因子Oct3/ 4、Sox2、Klf4、c-Myc 或3 个因子Oct3/ 4、Sox2、Klf4 成功将成年野生型小鼠牙龈成纤维细胞诱导为iPSC[4 基因诱导的iPSC(GF-iPS-4F），3 基因诱导的iPSC(GF-iPS-3F)]。这些细胞表现出与ESC 相似的形态结构和生长特性，且表达ESC 的标志基因，畸胎瘤形成实验显示iPSC 可分化为所有三胚胎层来源细胞。研究还发现GF-iPS-4F 细胞的重组效率比鼠尾尖成纤维细胞高7 倍，而GF-iPS-3F 细胞重组过程相对时间较长、效率较低，但其在DNA 甲基化状态和基因表达方面更接近于ESC。这些结果表明，从牙龈组织中获得的牙龈成纤维细胞可重编程后转化为iPSC，这给细胞重编程和多能性的基础研究及将来的临床应用提供了可靠的细胞来源。

4.2 牙髓来源的iPSC 牙髓组织来源丰富易于获得。智齿牙髓细胞中含有丰富的牙髓干细胞，Takeda[13]从180 多个年轻患者的智齿中分离获得牙髓细胞，发现这些牙髓细胞增殖能力强，易于培养且可长时间保存。Tamaoki 等[14]利用6 个不同发育阶段的牙髓细胞系，通过逆转录病毒载体将Oct3/ 4， Sox2， Klf4， c-Myc 导 入 细 胞 系 诱 导iPSC 生成，并以人皮肤成纤维细胞(human dermal fibroblast HDF)为对照。结果发现：在6组牙髓细胞系中，有5 组均可被诱导为iPSC，且诱导效率明显高于对照组，而另一组未能成功诱导的细胞系来源于年龄最大的捐献者(24 岁，男性，牙根已发育完全)；此外，同法只导入Oct3/ 4，Sox2， Klf4 三个转录基因也成功将牙髓细胞诱导为iPSC ，只是3 基因诱导效率低于4 基因，免疫染色、RT-PCR 等技术显示两者在表达人胚胎干细胞特定标志物等方面均无差异，而且3 基因诱导方案由于避免启用了c-Myc 这个致癌基因，在细胞安全性方面可能更有优势。此外，Beltrão-Braga PC 等[15]诱导人牙髓干细胞(human dental pulp stem cells，hDPSCs)也成功获得iPSC。且hDPSCs 诱导转化为iPSC，重编程速度快，获得的细胞具有类似ESC 的形态结构，可表达多能性标志物且有正常稳定的染色体组型，体内和体外实验均证明了其多能性特征。这表明hDPSCs 来源的iPSCs 也可为未来的细胞治疗提供稳定可靠的细胞体系。

4.3 牙周膜细胞诱导的iPSC 牙周膜(PDL)成纤维细胞是一种多潜能细胞，参与牙周膜的自我更新和牙周组织的再生。因此，相比于牙龈成纤维细胞和牙髓细胞，牙周膜成纤维细胞更具其独特性，这被认为其或许更适于重编程为iPSC。2011年，Wada N 等[16]利用逆转录病毒载体转导Yamanaka 因子，首次将牙周膜成纤维细胞重编程为iPSC。通过实时RT-PCR 基因检测、组织学观察形成畸胎瘤的能力结果表明：诱导出的iPSC表达人ESC 相关表面抗原SSEA3、SSEA4、GCTM-2、TG30 (CD9)、Tra-1-60 和人ESC 标志基因Oct4、Nanog 和Gdf3。体外研究显示诱导的iPSC 可表达三胚层相关基因。与之不同的是2012 年Nomura Y 等[17]采用Nanog、Lin28 代替c-Myc 基因，同样利用逆转录病毒载体将Oct3/ 4、Sox2、Nanog、Klf4、Lin28 五因子导入人牙周膜成纤维细胞(human periodontal ligament fibroblasts，HPDLFs)中，1 个月后，筛选出具ESC 样的细胞群落，经细胞STR 鉴定证实这些细胞 是 诱 导 得 到 的 iPSC (HPDL-iPSC)。 经RT-PCR 检测HPDL-iPSC 能够表达多能性标志基 因Oct3/ 4、 Sox2、 DPP4A、 Nanog、 Klf4、c-Myc 和Lin28，而HPDLFs 只表达其中部分多能性基因，且Oct3/ 4、Nanog、Klf4 的表达水平低于HPDL-iPSC，而c-Myc 的表达水平高于HPDL-iPSC，进一步免疫印迹法、ALP 活性分析、免疫荧光染色等技术证实这些基因的表达和HPDL-iPSC 可分化为成骨细胞、脂肪细胞、软骨细胞和神经细胞的潜能，小鼠形成畸胎瘤实验也表明其具有多向分化的潜能。这些结果表明HPDL-iPSC 的多能性，且说明HPDL-iPSC 具有良好的安全性。此外，在Nomura Y 等[17]的研究发现人牙周膜成纤维细胞的重编程效率达0.025%，相比于牙髓细胞(0.002-0.06%[14])和间充质细胞的重编程效率( 0.0026-0.0032%[18])，其更易诱导形成iPSC。以上结果表明牙周膜成纤维细胞诱导的iPSC 在细胞形态，分子标记和分化潜能等诸多方面都与ESC 极其相似，而且细胞来源简单、便捷。因此，研究认为牙周膜成纤维细胞或许可作为诱导iPSC 的较佳细胞来源。

4.4 口腔来源的iPSC 在全身疾病中的应用 目前，采用口腔来源的iPSC 对全身疾病进行治疗研究已取得初步成果。2012 年，Zou XY 等[19]使用慢病毒载体hSTEMCCA-loxP(一个多顺反子性的单载体搭载Yamanaka 因子)将人牙乳头干细胞(human stem cells of apical papilla ，SCAP)诱导为iPSC，然后利用Cre 重组酶介导的方法将转入的基因和载体删除，从而得到无外源基因(transgenefree)转入的iPSC (TF-iPSCs)，这些TF-iPSCs 具有ESC 特性，并在体外试验中证实其可分化为神经源性细胞，表达神经标记基因。因此，牙乳头干细胞来源的iPSC 可作为神经再生可靠的细胞来源。另外在Chen J 等[20]研究中还证实乳牙牙髓来源的iPSC(T-iPSCs)也可分化神经细胞，将T-iPSCs 和皮肤成纤维细胞来源的 iPSC(F-iPSCs)分化的人神经细胞基因对比研究，发现T-iPSCs 分化的神经细胞不但适合神经精神疾病的疾病模型，而且相比F-iPSCs 分化的神经细胞可能还有潜在优势。Yoo CH 等[21]只利用两个无致癌因子Oct4 和Sox2 成功将人牙髓细胞(hDPCs)转化 为 人 iPSC (2F hDPC-hiPSCs)， 并 将 2F hDPC-iPSCs 诱导分化为血管内皮祖细胞(2F-hEPCs)用于缺血性血管疾病的治疗研究。结果表明：相对其他细胞来源的hiPSCs，牙髓细胞来源的hiPSCs 分化为血管内皮祖细胞(endothelial progenitor cells，EPCs) 效 率 较 高， 得 到 的2F-hEPCs 具有生成血管能力，并可继续分化为功能性内皮细胞和平滑肌细胞。2F hDPC-hiPSCs具有强大的分化能力可生成EPCs，为病人特异性EPC 疗法提出了新策略，特别是适合用于缺血性血管疾病治疗。

5. iPSC用于口腔组织再生的应用研究

5.1 iPSC 向牙源性细胞诱导分化 牙形成过程中神经嵴细胞(neural crest cells，NCs)起关键作用。将ESC 向NC 细胞定向诱导，可分化为神经元细胞、雪旺氏细胞和间充质细胞，间充质细胞又可分化为脂肪细胞、软骨细胞和成骨细胞[22]。基于此，Otsu K 等[23]推测iPSC 也可分化为NC 细胞，继而用于牙再生。他们建立鼠胚胎成纤维细胞来源的iPSC 系， 将iPSC 定向诱导分化的细胞经实时RT-PCR 和流式细胞仪检测细胞表面标志mRNA及蛋白表达，证实分化得到的细胞为类神经嵴细胞(neural crest like cells，NCLC)。将NCLC 和鼠牙源性上皮细胞联合培养，2 周发现NCLC 细胞凝集在牙源性上皮周，免疫荧光检测发现这些聚集细胞可表达牙间充质细胞(DMC)标志物Lhx6、Msx1、Pax9，从而表明NCLC 可分化为DMC。令人感兴趣的是，一些NCLC 同时也表达成牙本质细胞标志物牙本质涎蛋白(DSP)，表明其也可分化为成牙本质细胞，而且血清和条件培养基更适合NCLC 向成牙本质细胞分化。此外，在细胞的增殖分化过程中金属基质蛋白酶-3(MMP-3)也发挥重要作用。外源性MMP-3 可促进类成牙本质细胞的增殖。较低浓度(0.25 或2.5 ng/ mL)IL-1β可诱导MMP-3 促进iPSC 分化的类成牙本质细胞增殖[24]。另外，Wen Y 等[25]对iPSC 在牙组织工程中的作用也进行了研究。发现小鼠胚胎成纤维细胞来源的miPSC 分化的细胞可表达牙源性和成骨性的基因谱。将其植入小鼠肾包膜下4 周，组织学结果显示有类骨和类牙髓样组织形成，表明miPSC 具有分化为牙源性细胞的潜能，可用于口腔组织再生。

5.2 iPSC 用于牙周组织再生 牙周组织再生研究是干细胞在口腔医学领域应用的重要方向之一，也是近年来的研究热点。贺慧霞等[26-27]将牙周膜干细胞分别与骨及粘骨膜组织工程支架材料HA／TCP、ADM 复合后体内移植，发现可显著提高牙槽嵴高度及附着龈缺损的修复效果。然而牙源性干细胞虽然可用于牙周组织再生，但由于它们来源有限而难以在临床上广泛应用。iPSC 的出现为细胞移植治疗带来了新的希望，近年来，国内外已有许多文献报道成功的将iPSC 诱导为间充质干细胞样细胞(iPSC-MSC)。诱导分化得到的iPSC-MSC 兼有两者的优势，其不仅保持了间充质干细胞的生物学特性，而且相比于传统的MSC有更强的增殖分化能力，可作为理想的种子细胞用于牙周组织再生修复。更令人振奋的是Karlsson C 等[28]研究发现获得的iPSC-MSC 不具有致瘤性，这提高了其在未来临床应用的安全性。2013 年，Hynes K 等[29]将人包皮来源的iPSC 诱导分化为MSC 样细胞，这些细胞具有MSC 的典型形态，表达MSC 的表面标记，将iPSC 来源的MSC 样细胞移植入鼠牙周缺损模型，2 周观察发现，实验组(iPSC-MSC)牙周缺损区有大量矿化组织和牙周膜样组织形成，面积覆盖整个缺损区域。而对照组(未移植iPSC-MSC)只在牙周缺损边缘区域有稀少的矿化组织形成。骨组织形态计量分析显示实验组新组织形成面积占缺损面积的51.31%，显著高于对照组29.77%。这表明iPSC 定向分化的MSC 能促进牙周组织再生，是简便易得、前景广阔的细胞来源，可用于牙周病的再生治疗。

牙周骨组织再生也是牙周再生的关键。Tang M 等[30]利用辅助载体pEB-C5 携带限定性因子诱导人骨髓CD34+间充质细胞重编程形成iPSC，并将其培养形成拟胚体后进一步筛选得到MSC 样细胞，流式细胞检测显示得到的iPSC-MSC 持续高表 达MSC 表 面 标 志 物CD29， CD44，CD166 和CD73 等，并可分化为脂肪细胞、软骨细胞和成骨细胞。将iPSC-MSC 接种于磷酸钙骨水泥支架(Calcium phosphate cement，CPC)，可见细胞在支架上粘附和增殖，表现出良好的生物活性。且在成骨诱导培养基中碱性磷酸酶(ALP)显著高于在对照组。这提示接种于CPC 支架的iPSC-MSC，在成骨诱导条件下具有良好的成骨分化能力，这为未来牙周及颌面部骨组织再生修复提供了新途径。

6. 问题与展望

干细胞研究是再生医学的基础。iPSC 技术的出现是干细胞基础研究领域的新突破，具有里程碑意义。iPSC 不仅来源，临床应用可避免免疫排斥及伦理难题，在研究组织功能和筛选新药、移植治疗遗传或退行性疾病等方面都具有广阔的应用前景。但iPSC 技术同时也存在重编程效率低、安全性欠佳等问题，这是其应用领域面临的重要挑战。影响iPSC 生成效率和安全性的原因是多方面的，来源细胞的特性是关键因素之一。目前能通过细胞重编程为iPSC 包括：皮肤成纤维细胞、角质细胞、脂肪干细胞、骨髓及牙组织来源的间充质干细胞等等。然而，目前研究中仍主要以成纤维细胞作为主要的供体细胞用于诱导iPSC，但近些年随着iPSC 技术在口腔领域的研究不断发展深入，新的研究发现在相同诱导条件下，口腔组织来源的细胞具有相对更高的重编程效率，且牙源性细胞的获取更加方便和安全，因而独具优势，已引起iPSC 研究者的广泛关注。相信随着对iPSC 研究的不断深入，其临床应用的障碍将不断取得突破，必将在医学疑难疾病的治疗中发挥越来越重要的作用。

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