■李 义 俞泉宇 陈亚军 何沅滨

(苏州大学基础医学与生物科学学院，江苏苏州215123)

中华绒螯蟹（Eriocheir sinensis）是我国主要的特种水产养殖品种之一。近年来，随着其规模化和集约化养殖程度的不断提高，病害日趋严重，时常造成巨大的经济损失。目前，在蟹病防治中仍然主要依靠水体消毒剂和内服抗菌药物，然而杀菌剂与抗生素的大量使用会带来水体污染、耐药性和药物残留等一系列问题。因此，寻求高效、环保、低毒副作用的药物，例如研发免疫增强剂，有效提高蟹体自身的免疫力与抗病力，已成为中华绒螯蟹饲料添加剂与病害免疫防治研究领域中的热点课题。研究表明，竹笋多糖（Bamboo Shoots Polysaccharide,BSP）具有抗氧化、抗补体及抗肿瘤作用，能提高健康，提高由环磷酰胺所致免疫抑制中华绒螯蟹的部分非特异性免疫指标活性。本试验在前人研究的基础上，通过体腔注射一定剂量的BSP，考察BSP对中华绒螯蟹的一些主要免疫指标的影响，以期进一步验证BSP对中华绒螯蟹免疫功能的调节作用，从而为开发适合中华绒螯蟹的绿色、无毒的BSP免疫增强剂与饲料添加剂提供参考依据。

1 材料与方法

1.1 试验动物及试剂

试验选择健康中华绒螯蟹300只，平均体质量为（23.86±0.37）g。BSP（多糖含量为65.3%）为本实验室自制；多聚-L-赖氨酸、氯化硝基四氮唑蓝（NBT）为Sigma产品；溶壁微球菌（Micrococcus lysodeikticus）冻干粉由苏州大学医学部提供；嗜水气单胞菌（Aeromonas hydrophila）CL99920菌株为浙江淡水水产研究所惠赠；超氧化物歧化酶测定试剂盒为南京建成生物工程研究所产品；其他试剂均为国产分析纯。

1.2 试验设计

试验设对照组和添加1、5、10、20 mg/kg BSP组5个处理组，每处理组设3个重复。试验蟹经过1周暂养后，挑选规格整齐、健康的个体称重后随机分组饲养于15个直径70 cm、高100 cm和水深45 cm的圆形玻璃钢桶内，每桶放养20只蟹。所有养殖桶均连接成一个自动的循环水养殖系统，每天早晚各投喂基础饲料（不含BSP）1次，投喂至饱食状态。试验期水温控制在（27±1.5）℃，并用增氧泵连续增氧。在注射竹笋多糖或生理盐水后第1、4、7和10 d，在5个处理组的每一重复中随机采取3只中华绒螯蟹，采集血淋巴液，制成抗凝血与血清备用。

1.3 测定指标及测定方法

1.3.1 免疫指标的测定

采样测定血细胞总数（Total haemocyte count,THC）、吞噬百分率（Phagocytic percentage,PP)、吞噬指数（Phagocytic index,PI）、呼吸爆发（Respiratory burst,RB）活性，血清溶菌酶（Lysozyme,LSZ）活性及超氧化物歧化酶(Superoxide dismutase,SOD)活性。THC、PP及PI的测定参照朱忠勇(1997)的方法适当修改后进行，PP为100个血细胞中吞噬有细菌的细胞数/100×100%，PI为100个参与吞噬的血细胞内的细菌总数/100；RB活性的测定参照Song等(1994)的NBT还原法适当修改后进行；LSZ活性的测定参照Hultmark等(1980)的方法适当修改后进行；SOD活性按试剂盒的要求进行测定。

1.3.2 抗病力（免疫保护率）的测定

在注射BSP后的第4 d，从每个处理组中取蟹6只（每一重复组中取蟹2只，然后集中放养在一起），以1.2×107cfu/kg体质量的剂量体腔注射接种中华绒螯蟹致病菌嗜水气单胞菌CL99920菌株菌悬液，每天投喂基础饲料至饱食状态，控制水温在25℃左右，并按常规进行管理，记录接种7 d后各组蟹的累积死亡率，计算抗病力（免疫保护率）。

1.4 统计分析

试验数值用“平均数±标准差（X±SD）”表示，采用SPSS（17.0）统计软件对数据进行单因素方差分析（One-way ANOVA），并用Duncan's检验法进行均值间多重比较。P＞0.05为差异不显著，P＜0.05为差异显著。

2 结果与分析

2.1 BSP对中华绒螯蟹THC的影响（见表1）

表1 BSP对中华绒螯蟹THC的影响（×106个/ml）

由表1可知，第1 d，10 mg/kg组的THC显著高于对照组和其他3个试验组（P＜0.05）；第4 d，1、5和10 mg/kg组的THC显著高于对照组和20 mg/kg组，5 mg/kg组显著高于10 mg/kg组（P＜0.05）；第7 d，4个试验组的THC均显著高于对照组，10 mg/kg组显著高于1、5和20 mg/kg组，20 mg/kg组显著高于1、5 mg/kg组，5 mg/kg组显著高于1 mg/kg组（P＜0.05）；第10 d，5个处理组之间无显著差异（P＞0.05）。由表1还可以看出，4个试验组的THC均呈先上升后下降的趋势，均在第7 d达到最大值，第10 d恢复至对照组水平；第7 d各试验组的THC均显著高于第1、4和10 d（P＜0.05）。以上结果表明，试验剂量的BSP均可使中华绒螯蟹的THC明显增加，从整体上看，以10 mg/kg剂量的BSP对中华绒螯蟹THC的提升效果较好。

2.2 BSP对中华绒螯蟹血细胞PP的影响（见表2）

表2 BSP对中华绒螯蟹血细胞PP的影响（%）

由表2可知，第4 d，4个试验组的血细胞PP均显著高于对照组，5 mg/kg组显著高于1、10和20 mg/kg组（P＜0.05）；第1、7和10 d，5个处理组的血细胞PP均无显著差异（P＞0.05）。由表2还可以看出，4个试验组的血细胞PP均在第4 d达到最大值，第7 d恢复至对照组水平并持续到试验结束的第10 d；第4 d各试验组的血细胞PP均显著高于第1、7和10 d（P＜0.05）。以上结果表明，试验剂量的BSP能不同程度地提高中华绒螯蟹血细胞的PP，从整体上看，以5、10 mg/kg剂量的BSP对中华绒螯蟹血细胞PP的提升效果较好。

2.3 BSP对中华绒螯蟹血细胞PI的影响（见表3）

表3 BSP对中华绒螯蟹血细胞PI的影响

由表3可知，第4 d，4个试验组的血细胞PI均显著高于对照组，5、10 mg/kg组显著高于1 mg/kg组（P＜0.05）；第7 d，5、10和20 mg/kg组的血细胞PI显著高于对照组，5 mg/kg组也显著高于1、10 mg/kg组（P＜0.05）；第 1、10 d，5个处理组之间无显著差异（P＞0.05）。由表3还可以看出，1、10 mg/kg组第4 d的血细胞PI显著高于第1、7和10 d（P＜0.05）；5 mg/kg组第4、7 d的血细胞PI显著高于第1、10 d，第4 d显著高于第7 d（P＜0.05）；20 mg/kg组第4 d的血细胞PI显著高于第1、7和10 d，第7 d又显著高于第10 d（P＜0.05）。以上结果表明，试验剂量的BSP对中华绒螯蟹血细胞PI均有较好的提升效果，均在注射多糖后第4 d达到最高值并于第10 d时恢复至对照组水平；从整体上看，以5、10 mg/kg剂量的BSP对中华绒螯蟹血细胞PI的提升效果较好。

2.4 BSP对中华绒螯蟹血细胞RB活性的影响(见表4)

表4 BSP对中华绒螯蟹血细胞RB活性的影响（OD630 nm值）

由表4可知，在整个试验期间，试验剂量的BSP对中华绒螯蟹血细胞RB活性均没有显著的影响（P＞0.05）。

2.5 BSP对中华绒螯蟹血清LSZ活性的影响（见表5）

表5 BSP对中华绒螯蟹血清LSZ活性的影响（U）

由表5可知，第1 d，4个试验组的血清LSZ活性均显著高于对照组，1 mg/kg组也显著高于5、20 mg/kg组（P＜0.05）；第4、7和10 d，5个处理组的血清LSZ活性无显著差异（P＞0.05）。由表5还可以看出，试验组第1 d的血清LSZ活性均显著高于第4、7和10 d（P＜0.05）。以上结果表明，试验剂量的BSP对中华绒螯蟹血清LSZ活性均有一定的提升效果，以1、10 mg/kg剂量的BSP对中华绒螯蟹血清LSZ活性的提升效果较好。

2.6 BSP对中华绒螯蟹血清SOD活性的影响(见表6)

表6 BSP对中华绒螯蟹血清SOD活性的影响（NU/ml）

由表6可知，第1 d，5个处理组的血清SOD活性没有显著差异（P＞0.05）；第4、7和10 d，4个试验组的血清SOD活性均显著高于对照组(P＜0.05)。第4 d，1 mg/kg组显著高于5、10 mg/kg组（P＜0.05）；第7 d，5、10 mg/kg组显著高于1、20 mg/kg组，1 mg/kg又显著高于20 mg/kg组（P＜0.05）；第10 d，1 mg/kg组显著高于其它各试验组，5、10 mg/kg组又显著高于20 mg/kg组（P＜0.05）。由表6还可以看出，1、20 mg/kg组第4 d的血清SOD活性最高，分别显著高于第1、7 d和1、7、10 d；5、10 mg/kg组第7 d的血清SOD活性最高，分别显著高于第1、4、10 d 和1、10 d。以上结果表明，注射试验剂量尤其是1～10 mg/kg的BSP能显著提高中华绒螯蟹血清SOD活性。

2.7 BSP对中华绒螯蟹抗病力（免疫保护率）的影响（见表7）

表7 BSP对中华绒螯蟹抗病力（免疫保护率）的影响

由表7可知，采用致病性嗜水性气单胞菌攻毒后7 d，对照组的累积死亡率达100%，而4个试验组的累积死亡率均低于对照组。由此表明，注射试验剂量的BSP可不同程度地增强中华绒螯蟹对致病性嗜水性单胞菌感染的抵抗力，以10 mg/kg组的免疫保护率最高（83.33%）。

3 讨论

3.1 BSP对中华绒螯蟹THC及吞噬功能的影响

研究表明，甲壳动物缺乏特异性免疫，血细胞在非特异性免疫防御反应中起着主要作用。THC的高低在一定程度上能体现抵抗病原体入侵能力的强弱。血细胞的吞噬作用及吞噬过程中因呼吸爆发而产生的活性氧在杀菌活性中起着重要作用。因此，测定THC、血细胞的PP、PI和RB活性，能较好地评价BSP对中华绒螯蟹血细胞免疫功能的影响。

Tania等（2008）发现，对南方滨对虾注射2.11、4.36 mg/kg的大肠杆菌脂多糖，试验虾的THC明显增加。Wang等的研究表明，在注射6 μg/g的几丁质和2、4 μg/g的壳聚糖后2 d，凡纳滨对虾的THC显著增加。王雪良发现，在对中华绒螯蟹注射2 mg/kg的酵母β-1,3/1,6-葡聚糖后第1 d，试验蟹的THC显著地高于注射生理盐水组。本试验结果表明，试验剂量的BSP能明显提高中华绒螯蟹的THC，以10 mg/kg的提升效果较好。这与上述研究的结果基本一致。

Cheng等(2004)的研究表明，注射50 μg/g的海藻酸钠后1、2、4 d，凡纳滨对虾的吞噬活性显著上升。王海丽等(2011)发现，注射南极寡营养细菌ANT52的脂多糖后第3、6 d，2、4 mg/kg两个剂量组的梭子蟹血细胞PP和PI均显著高于对照组。王雪良(2008)发现，对中华绒螯蟹注射2 mg/kg的酵母β-1,3/1,6-葡聚糖后1、3 d，血细胞的PP和PI较注射生理盐水组显著增加。本试验结果表明，在对中华绒螯蟹注射1、5、10和20 mg/kg的BSP后第4 d，各试验组的血细胞PP和PI均显著高于对照组，以5、10 mg/kg的效果较好。这与上述研究的结果基本一致。

Cheng等(2004)发现，对凡纳滨对虾注射20 μg/g的海藻酸钠后1 d，对虾的RB活性显著增加。Wang等(2005)的研究表明，注射2、4 μg/g的壳聚糖、6 μg/g的几丁质后2 d，凡纳滨对虾的RB活性显著增加。王雪良(2008)的研究表明，在对中华绒螯蟹注射2 mg/kg的酵母β-1,3/1,6-葡聚糖后第3 d，蟹的RB活性（·O2-产量）显著高于注射生理盐水组。本试验结果表明，对中华绒螯蟹注射试验剂量的BSP对血细胞RB活性没有显著影响，这与上述研究的结果不同。这可能与BSP对·O2-和H2O2具有极强的清除作用有关，蟹体内一旦有过多的·O2-和H2O2产生，就会被BSP直接清除一部分，剩余部分则通过BSP刺激增强的抗氧化机制（如本研究中SOD活性的增加）来消除，从而使呼吸爆发产生的·O2-始终维持在对照组水平。

3.2 BSP对中华绒螯蟹血清LSZ活性的影响

LSZ广泛存在于各种动植物中，在生物免疫防御系统中发挥重要作用。李红权等(2008)的研究表明，对日本囊对虾注射灰树花多糖后72、96 h，试验组的血清LSZ活性显著高于对照组。杨季芳等(2011)对三疣梭子蟹注射从南极海洋寡营养细菌中提取的脂多糖，第3、6 d，试验组的血清LSZ活性显著高于对照组。王雪良(2008)发现，以2 mg/kg的酵母 β-1,3/1,6-葡聚糖对中华绒螯蟹进行体腔注射，能显著地增加试验蟹的血清LSZ活性。本试验结果表明，对中华绒螯蟹注射1、5、10和20 mg/kg的BSP后第1 d，各试验组的血清LSZ活性均显著高于对照组，以1 mg/kg组的活性最高，第4 d时恢复至对照组水平。本试验结果与上述研究的结果类似，但BSP对中华绒螯蟹血清LSZ活性的增加作用以低剂量的效果较好且各试验剂量引起的免疫效应持续的时间均较短，其原因有待进一步研究。

3.3 BSP对中华绒螯蟹血清SOD活性的影响

SOD在清除活性氧、防止分子损伤、增强吞噬细胞功能中发挥着重要的作用。SOD活性的变化可以作为衡量甲壳动物免疫水平的指标。王海丽等(2011)研究证实，注射2、4 mg/kg的南极寡营养细菌ANT52脂多糖能显著提高梭子蟹血清SOD活性，2 mg/kg的效果优于4 mg/kg。李红权等(2009)的研究表明，注射1%灰树花多糖溶液96 h后，日本沼虾血清SOD活性显著上升。沈锦玉等(2004)对中华绒螯蟹注射1%海带多糖溶液，发现注射后48 h，蟹血清SOD活性极显著高于对照组。本试验结果表明，对中华绒螯蟹注射适量的BSP可显著增强血清SOD活性。这与上述研究的结果相一致，也与本试验中血细胞RB活性在整个试验期无显著变化的结果相一致。Lin等(2008)的试验表明，锯缘青蟹在注射β-葡聚糖后6～48 h，在注射肽聚糖后6～72 h，血细胞中的胞外铜锌超氧化物歧化酶（ecCuZnSOD）基因转录量显著增加。为此推测注射BSP刺激中华绒螯蟹SOD活性显著增加的分子机制有可能也是使SOD的基因表达量显著增加所致，是否如此，有待进一步研究证实。

3.4 BSP对中华绒螯蟹抗病力的影响

研究表明，注射6 μg/g的几丁质和4 μg/g的壳聚糖、注射10 μg/g的海藻酸钠能明显增强凡纳滨对虾对溶藻弧菌的抵抗力；注射β-1,3/1,6-葡聚糖、海带多糖、米糠多糖或山药多糖、海藻酸钠或壳聚糖，均能增强中华绒螯蟹对嗜水气单胞菌感染的抵抗力。本试验结果表明，注射BSP也能明显增强试验蟹对嗜水气单胞菌感染的抵抗力，这与上述研究结果一致。

4 结论

试验结果表明，对中华绒螯蟹体腔注射适量的竹笋多糖在一定时间内能显著地提高其THC、血细胞PP及PI，显著地增强其血清LSZ与SOD活性，并能不同程度地增强中华绒螯蟹对嗜水气单胞菌感染的抵抗力，以10 mg/kg体质量剂量的效果较好。由此表明，竹笋多糖能调节中华绒螯蟹的免疫机能，可作为中华绒螯蟹潜在的免疫增强剂和饲料添加剂。

（参考文献24篇，刊略，需者可函索）