李铁柱，杜红岩，王 淋

(1.中国林业科学研究院 经济林研究开发中心，河南 郑州 450003；2.国家林业局杜仲工程技术研究中心，河南 郑州 450003；3.中南林业科技大学 林学院，湖南 长沙 410004)

杜仲是我国传统的药用植物，叶片和果实中含有大量的绿原酸等活性成分[1-5]，肉桂酸-4-羟化酶(Cinnamic Acid 4-Hydroxylase，C4H)，是绿原酸合成途径中的关键酶[6]。

肉桂酸-4-羟化酶也叫苯乙烯酸4-脱氢酶，C4H分布在微粒体中，能够原位利用PAL催化产生的苯乙烯酸。C4H是细胞色素单加氧酶P450超家族的成员之一，该酶由Russell和Conn首次从豌豆芽中发现[7]，它是苯丙素类化合物生物合成途径里继PAL(苯丙氨酸脱氨酶)之后的第2个关键调节酶[8-9]。拟南芥的C4H为单一位点编码，基因启动子在PAL和4CL基因中的顺式作用组分也有保留，它控制着对紫外线照射、光和elicitor激活因子处理反应，C4H基因编码的mRNA以及蛋白质的调节是严格与苯丙氨酸脱氨酶的 mRNA和蛋白质同步调节的，以此普遍认为肉桂酸-4-羟化酶是苯丙素类物质代谢中一个调节点。由于肉桂酸-4-羟化酶基因在植物次生代谢中有这些重要的作用，因此受到关广泛关注。自从上世纪80年代以来，肉桂酸-4-羟化酶基因的克隆渐渐成为一个研究热点。 迄今，已有多种植物的C4H基因被分离出来[10-11]。和苯丙氨酸脱氨酶基因类似，肉桂酸-4-羟化酶基因的拷贝数在不同植物之间存在差异。比如苜蓿C4H基因有2个拷贝，豌豆Pisumsal sativum的C4H基因只有一个拷贝，绿豆和长春花的C4H基因家族都有多个成员。这些不同植物种的C4H基因所编码的氨基酸序列相似性极高，同源性普遍在85％左右。但玉米和法国菜豆的2个C4H酶蛋白氨基酸序列例外，同源性只有60％[12]。

文中对C4H基因全长cDNA序列进行了系统的生物信息学分析，旨在为杜仲绿原酸等活性成分合成的分子调控提供理论依据。

1 材料与方法

分别于2010年5月28日和10月28日，在中国林业科学研究院经济林研究开发中心采集杜仲优良品种“华仲6号”的叶片和果实，提取RNA，送至深圳华大基因公司进行转录组测序和基因功能注释[13-14]。

转录组测序得到的Unigene，利用NCBI网站上的BLAST工具，与其它物种已知的CDS序列进行在线比较，用相似性得分比较高的已知基因确定并命名杜仲转录组中的待分析基因。确定基因后，分析该基因(或基因家族)在杜仲叶片和果实中的表达量，推断该基因在杜仲活性成分生物合成中的地位和作用。对杜仲胶合成时期转录组数据组装及基因功能注释和杜仲基因组测序数据进行序列生物学分析。利用 ExPASyProtParam(http://cn.Expasy.org)程序与ScanProsite程序对杜仲C4H家族各成员的氨基酸残基数目、氨基酸残基组成比例、基因编码蛋白质的分子量、理论等电点以及编码蛋白质的亲疏水性等性质进行了预测与分析；利用GOR4程序(http://bioinf.cs.ucl.ac.uk/psipred)预测EuC4H蛋白质的二级结构；利用 Swiss-model(http://swissmodel.expasy.org/)程序，根据基因氨基酸序列，在PBD(Protein data bank，http://www.rcsb.org/pdb/home/home.do)数据库搜索相似序列， 采用alignment mode建模的方式进行同源建模，预测EuC4H蛋白质的三级结构；用MEGA软件进行遗传系统分析，构建EuC4H系统发育进化树。

2 结果与分析

2.1 EuC4H基因与其它植物种序列相似性

EuC4H1(Unigene9197)氨基酸序列与川椒Capsicum annuum(ACF19421.1)、 紫 草Lithospermum erythrorhizon(BAB71716.1)、 马铃薯Solanum tuberosum(ABC69046.1)、悬钩子Rubus occidentalis(ACM17896.1)、丹参Salvia miltiorrhiza(ABC75596.1)的C4H氨基酸序列的相似性分别为90％、90％、91％、89％、89％(见图1)。将EuC4H1基因cDNA全长序列命名为EuC4H1。其cDNA全长为1 641 bp，编码547个氨基酸。

另外，EuC4H2基因Unigene21793的氨基酸序列与杨树(XP_002331408.1)、烟草(AAK62344.1)、葡萄(XP_002266037.1)、人参(AEY75219.1)、甜橙(AF255013_1)C4H氨基酸序列的相似性分别为77％、77％、79％、78％、76％，EuC4H2全长为1 611 bp，编码537个aa。

2.2 EuC4H编码蛋白的理化特性

用ExPaSy ProtParam程序预测EuC4H1和EuC4H2编码蛋白的相对分子质量分别为62.94kD和60.96kD，理论等电点为9.34和8.85；氨基酸组成中都以亮氨酸、精氨酸、缬氨酸和异亮氨酸含量最高，蛋白不稳定系数分别为49.91和49.67，均属于不稳定蛋白质。TargetP 1.1 Server工具推断EuC4H1和EuC4H2编码蛋白都属分泌蛋白，分值为0.840，可靠性为3级。

2.3 EuC4H编码蛋白的亲水/疏水性分析

用Expasy Protscale程序分析杜仲C4H1和EuC4H2的编码蛋白疏水/亲水性，结果如图2所示，EuC4H1蛋白氨基酸残基中分别以A56和A45疏水性最强(1.971和2.049)，分别以A307、A276亲水性最强(-0.996和-0.933)，亲水氨基酸的数量小于疏水氨基酸，故推断2个EuC4H编码蛋白均为疏水性蛋白。

2.4 EuC4H编码蛋白二级结构与保守结构域预测

以GOR4程序预测EuC4H1和EuC4H2蛋白二级结构中α-螺旋分别占46.07％和37.80％，β-折叠占15.36％和16.76％，无规卷曲结构占38.57％和45.44％，两者均属于混合型结构的蛋白质(见图3和图4)。

图1 EuC4H全长cDNA氨基酸序列与同源序列的多重比对Fig.1 Multiple alignment of full length amino acid sequence of EuC4H and homologous sequences

图2 EuC4H1和EuC4H2蛋白的亲水/疏水性预测Fig.2 Prediction of hydrophobicity and rophilicity of EuC4H1and EuC4H2 proteins

保守结构域分析结果见图5和6，EuC4H基因编码蛋白为多结构域蛋白，属Cypx超家族。

2.5 EuC4H编码蛋白三级结构

采用自动建模的方式对EuC4H1蛋白进行同源建模(见图7A)。以人的细胞色素P450 2D6(Human cytochrome P450 2D6 with two thioridazines bound in)为模板，蛋白模型QMEAN 得分为0.522，与人的细胞色素P450 2D6的相似性为23.27％[15-18]。

采用自动建模的方式对EuC4H2蛋白进行同源建模(见图7B)。以人的细胞色素P450 2D6(Human cytochrome P450 2D6 with two thioridazines bound in)为模板，蛋白模型QMEAN 得分为0.516，与人的细胞色素P450 2D6的相似性为22.50％。

图4 EuC4H2蛋白二级结构预测Fig.4 Prediction of secondary structure of the deduced EuC4H2 protein

图5 EuC4H1蛋白的保守结构域预测Fig.5 Prediction of conserved domains of the deduced EuC4H1 protein

图6 EuC4H2蛋白的保守结构域预测Fig.6 Prediction of conserved domains of the deduced EuC4H2 protein

图7 EuC4H蛋白三级结构预测Fig.7 Prediction of tertiary structure of the deduced EuC4H protein

2.6 C4H基因系统进化树

肉桂酸-4-羟基化酶(C4H)是苯丙烷类代谢途径的第1个羟基化酶，是一种与细胞色素P450密切相关的单氧化酶，C4H能利用PAL产物肉桂酸形成对-羟基香豆酸[19]。系统发育树表明：杜仲中分离的基因序列也与烟草、紫草、矮牵牛的C4H蛋白聚在一起(见图8和图9)，说明EuC4H很可能是杜仲苯丙素类物质合成的关键基因，影响杜仲木质素的合成代谢。

图8 C4H同源蛋白的系统进化树分析Fig.8 Phylogenetic analysis of C4H homologous proteins

图9 EuC4H系统发育树Fig.9 EuC4H phylogenetic tree

3 结论与讨论

杜仲肉桂酸-4-羟化酶(EuC4H)，其cDNA全长为1 641 bp，编码547个氨基酸，EuC4H相对分子质量为62.94kD，理论等电点为9.34；氨基酸以亮氨酸、精氨酸、缬氨酸的含量较高，疏水性不稳定蛋白质；EuC4H二级结构中α-螺旋占46.07％，β-折叠占15.36％，无规卷曲结构占38.57％，属于混合型结构的蛋白质，属Cypx超家族。

肉桂酸-4-羟化酶(C4H)基因相对而言，以小基因家族存在，遗传多样性低，保守性较高的基因，如EuC4H基因与川椒Capsicum annuumACF19421.1、 紫 草Lithospermum erythrorhizonBAB71716.1、 马 铃 薯Solanum tuberosumABC69046.1的氨基酸序列相似性高达90％以上。本研究在转录组研究的基础上，从杜仲果实和叶片中分离鉴定了2种C4H基因。

有报道发现，肉桂酸-4-羟化酶的表达与植物的木质化进程关系密切[20]。研究欧芹肉桂酸-4-羟化酶表达模式显示，C4H基因在木质化程度高的花梗中表达丰富，但在幼嫩叶片和成熟叶片中均不表达[21]；拟南芥的肉桂酸-4-羟化酶基因也在木质化的细胞中表达量最为丰富[22]，对肉桂酸-4-羟化酶功能系统研究发现，在高等植物的生长发育各阶段或者各种外界因子如机械损伤、真菌感染以及化学诱导、激发子等的刺激下，肉桂酸-4-羟化酶基因编码的mRNA积累水平和变化趋势与苯丙氨酸脱氨酶趋于一致。因此，下一步应开展杜仲C4H基因对绿原酸生物积累的贡献方面的系统研究，为C4H基因的分子调控机理研究提供依据。

[1] 杜红岩,胡文臻,俞 锐.中国杜仲橡胶资源与产业发展报告[R].北京:社会科学文献出版社,2013:141-144.

[2] 杜红岩,刘昌勇,李 钦,等.杜仲叶中3种主要活性成分含量的季节变化[J].中南林业科技大学学报,2011,31(8):6-9.

[3] 杜红岩,李 钦,杜兰英,等.杜仲雄花茶营养成分的测定分析[J].中南林业科技大学学报,2007,27(6):88-91.

[4] 刘淑明,梁宗锁,董娟娥.不同水分条件下皮叶两用杜仲林的生长效应[J].中南林业科技大学学报,2007,27(5):49-53.

[5] 杜红岩,刘攀峰,孙志强,等.我国杜仲产业发展布局探讨[J].经济林研究,2012,30(3):130-144.

[6] 杜红岩.杜仲活性成分与药理研究的新进展[J].经济林研究,2003,21(2):58-61,82.

[7] Russell DW,Conn EE.Cinnamic Acid 4-Hydroxyiase of Pea Seedlings[J].Archives of Biochemistry,1967,122:256-258.

[8] Barber M S,Mitchell H J.Regulation of phenylpropanoid metabolism in relation to lignin biosynthesis in plants [J].Int Rev Cytol,1997,172: 243-293.

[9] 李 波,梁 颖,柴友荣.植物肉桂酰辅酶A还原酶(CCR)基因的研究进展[J].分子植物育种,2006,4(3S): 55-65.

[10] Mizutani M,Ward E,DiMaio J,et al.Molecular cloning and sequencing of a cDNA encoding mung bean cytochrome P450 possessing cinnamate-4-hydroxylase acticity[J].Biocbean Biopbys Res Commum,1993,190: 875-880.

[11] Teutsch H G,Hasenfratz M P,Lesot A,et al.Isolation and sequence of a cDNA encoding the Jerusalem artichoke cinnamate-4-hydroxylase,a major plant cytochrome P450 involved in the general phenylpropanoid pathway[J].Proc Natl Acad Sci USA,1993,90: 4102-4107.

[12] Nedelkina S,Jupe S C,Blee K A,et al.Novel characteristics and regulation of a divergent cinnamate 4-hydroxylase (CYP73A15)from French bean: engineering expression in yeast [J].Plant Mol Biol,1999,39: 1079-1090.

[13] 李铁柱,杜红岩,刘慧敏,等.杜仲果实和叶片转录组数据组装及基因功能注释[J].中南林业科技大学学报,2012,32(11):122-130.

[14] 李铁柱,杜红岩,刘慧敏,等.杜仲幼果和成熟果实转录组数据组装及基因功能注释[J].中南林业科技大学学报,2012,32(10): 9-17.

[15] Benkert P,Biasini M,Schwede T.Toward the estimation of the absolute quality of individual protein structure models [J].Bioinformatics,2011,27(3):343-350.

[15] Arnold K,Bordoli L,Kopp J,et al.The SWISS-MODEL Workspace: A web-based environment for protein structure homology modelling [J].Bioinformatics,2006,22(11),195-201.

[17] Schwede T,Kopp J,Guex N,et al.SWISS-MODEL: an automated protein homology-modeling server[J].Nucleic Acids Research,2003,31(13):3381-3385.

[18] Guex,N,Peitsch M C.SWISS-MODEL and the Swiss-PdbViewer: An environment for comparative protein modelling[J].Electrophoresis,1997,18: 2714-2723.

[19] 吕淑萍,倪志勇,范 玲.木质素生物合成相关酶基因调控的研究进展[J].分子植物育种,2011,9(3):1545-1555.

[20] Chapple C.Molecular-genetic analysis of plant cytochrome P450-dependent monooxygenases[J].Annu Rev Plant Physiol Plant Mol Biol,1998,49: 311-343.

[21] Koopman E,Logemann E,Hahlbrock K.Regulation and functional expression of cinnamate 4-hydroxylase from parsley[J].Plant Physiol,1999,119: 49-55.

[22] Bell-Lelong D A,Cusumano J C,Meyer K,et al.Cinnamate-4-hydroxylase expression in Arabidopsis (Regulation in response to development and the environment)[J].Plant Physiol,1997,113:729-738.